二代测序检测在无反应性肺炎诊治中的临床应用

林 海，袁小亮

（赣南医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科/国家老年医学临床研究中心赣南分中心，江西 赣州 341000）

社区获得性肺炎（Community acquired pneumonia，CAP）是一种常见的感染性疾病，部分CAP经初始抗感染治疗无明显改善甚至恶化，即无反应性肺炎（Nonreactive pneumonia，NP），其病死率为普通CAP的3～5倍，总病死率可高达49.00%［1］，因此引起感染的病原体的鉴定和特征分析对于准确治疗和加速康复极为重要［2］。多数患者住院前已使用过抗生素抗感染治疗，以致传统检测方法费时且阳性检出率低［3］。此外，基于培养的技术，核酸扩增试验和免疫学分析只针对目前已知的一小部分病原体，且敏感性欠佳，因此通常容易出现假阴性结果，可能导致滥用或过度使用抗生素［4］。

随着分子生物学的发展，基于全基因组的新一代微生物测序（Next-generation sequencing，NGS）的价值逐渐被人们所认识，特别是用于检测罕见、非典型或生长缓慢的微生物［5］。NGS主要用于临床评估无菌体液，包括脑脊液、血液和关节积液［6］。对于非无菌体液，如痰和支气管肺泡灌洗液（BALF），NGS的应用相当有限。除了人类基因组干扰和其他常见问题之外，对NGS结果的解释（区分定植和感染）也是一个主要问题。近年来，mNGS在呼吸道感染病原学检测和鉴定中的可行性已被证实［7］。本研究总结了30例无反应性肺炎患者BALF的mNGS结果，并试图通过对测序结果的解读，验证mNGS在无反应性肺炎诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料与标本收集 回顾性分析2019年1—12月我院呼吸与危重症医学科收治的30例无反应性肺炎患者的临床资料（参照《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南2016版》标准）［8］。本研究经医院医学伦理委员会批准。纳入标准：①年龄＞18岁；②符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南》2016版本中无反应性肺炎的诊断；③排除支气管镜检查禁忌症，并签署有创操作知情同意书。排除标准：①妊娠期妇女；②合并肺外感染。

所有患者入院后立即进行血液检测，评估白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞计数、C反应蛋白（CRP）和降钙素原（PCT）等炎症标志物。所有患者均通过胸部CT检查，以评估肺部病灶情况。随后需要对这些患者的疾病状况进行支气管镜检查，以便收集BALF液，通过mNGS分析进一步进行病原体鉴定，以促进临床治疗。由经验丰富的医生行支气管镜检查，采集BALF样本，将5 mL规格标本置于无菌痰液容器中，−20℃保存，送华大基因科技有限公司（中国深圳）行mNGS检测。剩下的标本送微生物及分子检验实验室进行细菌、真菌涂片和培养，卡氏肺孢子虫（PC）涂片，抗酸染色；荧光定量PCR检测巨细胞病毒（CMV）、流感A/B病毒、PC、结核分枝杆菌、支原体和衣原体。

1.2 mNGS检测内容与检测方法 对样本中的核酸进行检测，鉴定样本中存在的可疑致病微生物，可检测范围包括基因组序列已知的6350种细菌（其中包括133种分枝杆菌和122种支原体/衣原体/立克次体）、4945种病毒（包括DNA和RNA病毒）、1064种真菌和234种寄生虫。采用高通量测序技术，对样本中微生物核酸序列进行分析，通过与数据库中已有微生物的核酸序列进行比对，从而对微生物进行鉴定。高通量测序检测过程包括：核酸提取、文库构建、测序、信息分析、报告解读等（具体详见深圳华大基因科技有限公司详细说明）。

检出总序列数：经高通量测序方法检测得到的核酸序列总数。

检出序列数：样本中检出的微生物核酸序列的总数。

1.3 检测结果的判读 判定为感染性病原体需满足下列任一条件［9］：（1）细菌的判定要求检出序列数≥100，基因组覆盖度＞0.3，无论培养或涂片结果如何；（2）培养和mNGS鉴定出相同的微生物，单个物种的检出序列数≥50。如果mNGS单独识别微生物，则认为微生物是新的潜在病原体。这些微生物基于严格的临床标准，并结合多临床医生裁决，严格区分感染、定植和污染。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS23.0进行分析，计量资料以±s表示，计数资料n（%）表示。采用卡方检验比较mNGS与常规涂片、核酸检测或培养方法的诊断效率，采用线性回归分析方法评价BALF的mNGS检测与其他因素的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例资料 30例患者均因胸部CT表明肺部病灶扩散并伴有肺不张或胸膜积液诊断为无反应肺炎，其中男性19例，女性11例，平均年龄（53.57±18.71）岁，9例合并呼吸衰竭被送入RICU，7例患者存在免疫功能低下。入院时发热持续时间平均为（7±2.82）天，13例患者在就诊前7天出现发热。白细胞总数为2.25×109·L-1～22.13×109·L-1，淋巴细胞总数为0.35×109·L-1～11.2×109·L-1，中性粒细胞总数为1.03×109·L-1～22.37×109·L-1。其中白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞正常的病例数分别为14例、17例、21例。16例血清CRP高于10.0 mg·L-1，22例PCT高于0.5μg·L-1。所有病例均采用经验性抗生素抗感染治疗，并完善支气管镜检查，起病后气管镜检查平均天数为（9.3±6.36）天。见表1。

表1 30例患者一般资料

2.2 病原学检测与分析 根据感染的定义，排除了常见的细菌定植。BALF mNGS与细菌培养、涂片/PCR比较，mNGS的诊断阳性率均增加，差异有统计学意义（P分别为0.020和0.036），其中有6例mNGS检测结果为阳性，培养、涂片及PCR检测结果均为阴性。样本共检测出现肺孢子菌病（Pneumocystis carinii pneumonia，PCP）共5例（1例序列数为23），其中3例为免疫功能低下患者，除1例免疫功能低下患者外，其余病例采用涂片或核酸法亦检测出PCP，而mNGS检出阳性率为100%。7例免疫功能低下患者样本中共检测PCP 3例，CMV 2例，链球菌1例，1例铜绿假单胞菌，1例曲霉菌。样本中共检测病原体考虑为定植主要有白色念珠菌、肠球菌、链球菌、鲍曼不动杆菌、人类疱疹病毒4型、窄食单胞菌、马拉色菌及奈瑟菌等。1例患者的mNGS和传统检测方法结果均为阴性，后经皮肺穿刺病理诊断为肺结核；另有1例患者传统检测方法结果为阴性，mNGS检出PCP序列数少于50，后经全院扩大会诊后考虑为不排除PCP感染可能，但至患者死亡仍未能确诊病原学（表2、表3）。

表2 mNGS与传统检测方法病原检测结果对比

表3 mNGS与传统检测方法检出并判断为感染的病原体属及样本数

对于mNGS中序列数小于50的样本，可间接反映下呼吸道细菌和真菌菌群的多样性。线性回归分析显示：检出菌群数的差异与起病至采样的间隔时间显著相关，表现为间隔时间越长，mNGS检测病原体菌群数越多；而与吸烟史长短及白细胞、CRP、PCT等炎症指标情况无关（图1）。

图1 mNGS检测病原体属数的差异与起病至采样间隔时间的关系

2.3 治疗策略 12例患者因mNGS发生了治疗策略的改变，其有4例mNGS阳性发现（2例PCP、1例结核分枝杆菌、1例曲霉菌），以及对于鲍曼不动杆菌、烟曲霉感染，mNGS较培养法更早地鉴定了病原菌，使得及时更改了有效地抗感染治疗。1例患者实验室方法和mNGS结果均为阴性，结合其自身免疫系统检测指标，与风湿免疫科会诊后考虑皮肌炎，予转入风湿免疫科给予相关治疗。此外1例患者的mNGS和常规方法结果均为阴性，结合其感染证据不足和肺部CT的动态改变，考虑为感染后机化 性肺炎，予甲泼尼松龙治疗后病灶吸收明显（表4）。

表4 mNGS病原体检测结果及其导致治疗策略的改变

3 讨论

mNGS适用于传统检测技术无法识别的病原体的检测，也适用于患者对标准化抗感染治疗无反应的情况［10］。对于稀有或生长缓慢的病原体，mNGS在缩短病原体的确诊时间和促进针对性的抗感染治疗等方面有相当大的优势，能极大地改善患者的预后［11］。然而，mNGS应与流行病学和临床特征相结合，才能确定病原微生物。由于技术方面（如消除宿主基因影响的方法）和结果的解释，mNGS的应用仍存在争议。到目前为止，关于mNGS的研究大多集中在其对特定细菌感染的诊断价值［12］，关于准确解释所有检测结果的文献很少。本研究根据文献［13］，通过分析BALF临床样本中微生物DNA水平及其相对丰度水平来鉴定致病菌。该方法显著提高了病原学检测的敏感性，对临床实践具有指导意义。

有文献表明［14］，mNGS鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的阳性率较差。本研究发现1例患者的Xpert MTB/RIF结果和另1例患者的痰抗酸染色涂片为阳性，mNGS提示存在结核分枝杆菌，但未能鉴定出特异性菌株，mNGS能辅助结核感染的诊断，而菌株的鉴定及耐药性分析仍需依赖于培养菌的全基因组测序。30例患者中有12例改变了治疗策略，可能是因为我科收治转入患者较多，多数患者入院前已予抗感染治疗，入院后给予强效、广谱抗感染治疗，但通过BALF联合mNGS能更好地优化抗感染治疗策略。在本研究中，传统的方法与mNGS的高符合率进一步验证了mNGS的有效性和准确性。对于检测能力有限的医院，建议根据当地流行病学特征，特别是对免疫功能低下的患者和有严重或复杂感染的患者，推荐使用mNGS检测。

基于序列数和相对丰度，mNGS技术可用于半定量检测［15］。本研究有2例患者经历了2次BALF mNGS检测，PC和腺病毒核酸序列数的动态变化可以间接反映治疗效果。此外，mNGS可用于腺病毒基因分型，从而提供更好的临床实践指导［16］。因病毒培养困难且核酸检测的假阳性率较高，检测到的DNA病毒是否为致病性微生物的报道较少，而mNGS测定的序列数和相对丰度可为确定病毒感染的提供一定的依据，但是需要进一步的实验来验证其最佳参考值。

mNGS还能识别不同条件下气道菌群的分布。文献表明气道菌群组成与吸烟史无关，而与机械通气时间有关［17］。本研究表明起病至采样的间隔时间与呼吸道菌群存在一定相关性。下呼吸道是一个相对无菌的解剖部位，但随着疾病时间的延长，呼吸道菌群类型可能会发生变化，这可能与菌群迁移有关，而呼吸道微生物群落多样性的丧失，可作为一个呼吸道感染的标志［18］。

本研究受到样本量小和纳入患者有基础疾病等多重限制，同时未进行全基因组RNA测序，可能存在有些RNA病毒尚未被检测到，且也未进行耐药性测试。虽然mNGS在呼吸道感染性疾病中已被广泛接受和应用，但mNGS的成本可能仍然是大多数医院在常规诊断中实施的障碍，同时也尚无统一的标准来修改或指导临床治疗策略，特别是在样品制备和数据处理方面，限制了其在临床研究中的广泛应用。然而，在临床诊断中实施mNGS是有前景的，应该被临床医生接受，在传统的分子方法无法发现病原体或病情复杂的情况下，mNGS作为一种诊断工具是有优势的。

4 结 论

宏基因组NGS可提高无反应肺炎病原菌检测的敏感性，在缩短病原体的确诊时间和促进针对性的抗感染治疗等方面具有相当大的优势，能极大地改善患者的预后。此外，mNGS将提供更多特定菌株的信息，将有助于识别新的病原体，并可能有助于追踪和控制感染暴发。如mNGS能进一步对宿主的炎症介质或免疫相关因子及病原体耐药性也进行检测及分析，将给抗感染精准治疗带来更大的获益。