悬浮法及酶消化法分离培养脂肪干细胞

赵雅丽，李瑞方，熊丽娇，曾治平

（1.赣南医学院2019级硕士研究生；2.赣南医学院第一附属医院全科医学科；3.国家老年疾病临床医学研究中心赣南分中心，江西 赣州 341000）

脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells，AD- SCs）是从脂肪组织中分离得到的一种具有异质性的间充质干细胞，它具有多种属性标记，可分化为多种类型的细胞，如脂肪细胞、肌细胞、软骨和骨细胞等［1-2］。ADSCs与骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）相比，更容易获得，并且在采集时具有相对较低的供区发病率。单细胞转录表明ADSCs对比BMSCs来说是一种更可控的干细胞来源，在调节炎症方面更具优势［3］，且在促进体内外造血方面ADSCs也明显优于BMSCs［4］，ADSCs方便分离的特性和强大的体外增殖能力，也使得ADSCs在再生医疗领域中非常受欢迎［5-6］。本文就ADSCs的分离、培养与鉴定进行研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 6周龄的雄性大鼠（由赣南医学院科研动物中心提供），操作前后符合《关于善待实验动物的指导性意见》［7］标准。优质胎牛血清（四季青无噬菌体内毒素），DMEM低糖培养基（Gibco），Trypsin-EDTA（0.25%phenol red），0.2%Ⅰ型胶原酶（Collagenase），磷酸盐缓冲液（PBS，自配），青霉素−链霉素（索莱宝），完全培养基（DMEM低糖完全培养基−初级）、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、茜素红、油红O等。BBS-SDC医用洁净工作台、Thermo CO2培养箱、DK-8D型电热恒温水箱、TDZ5-WS台式低速离心机、BCD-601WDPR低温冰箱、流式细胞仪、倒置显微镜等（由赣南医学院第一附属医院科研中心提供）。

1.2 实验方法

1.2.1 ADSCs提取

1.2.1.1 胶原酶消化提取法 （1）取6周龄雄性大鼠，将大鼠脱颈处死，在无菌条件下取大鼠腹股沟处脂肪组织，用加入双抗的磷酸盐缓冲盐水（PBS）充分漂洗3～4遍，放入装有PBS的培养皿中，剔除肉眼可见的血管及筋膜组织。（2）将其剪碎，大小最好约1 mm3左右，再用无菌的PBS反复冲洗，尽可能除去红细胞。（3）将其装入50 mL的试剂瓶中，并加入等量的0.2%Ⅰ型胶原酶，于37℃的恒温水浴箱中消化50 min，期间间断摇晃试剂瓶使其消化均匀。（4）加入两倍体积含有PBS的低糖DMEM培养液，轻轻吹打离散细胞团，将形成的单细胞悬液装入15 mL离心管中1690 r·min-1，离心10 min。（5）除去上层的脂肪和上清液，收集所得到的细胞沉淀物，加入DMEM培养液吹打细胞沉淀，并将吹打后的混悬液置入37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。

1.2.1.2 悬浮组织块提取法 （1）第一步同上述胶原酶提取法。（2）将脂肪组织剪成约绿豆大小，用PBS冲洗2～3遍。（3）接种到6 cm的平皿中，每皿放置6～8块已剪好的脂肪组织，加入6～8 mL的DMEM培养液使组织块悬浮。（4）轻轻晃匀后置于37℃，5%的CO2培养箱中培养。（5）5～6 d后首次换液，当细胞达90%融合时用胰酶进行1∶3传代，记为原代P1。

1.2.2 ADSCs传代 两种方法传代方法一致，将提取到的原代ADSCs培养24 h后首次换液，去掉残存的细胞碎片及红细胞，48 h后再次换液，之后每48～72 h换液1次，获得纯化的ADSCs，总计培养8～10 d后。观察原代ADSCs密度，一般融合生长达到90%左右，可进行传代，用0.25%胰蛋白酶常规消化后，进行传代培养。一般传代3代进行细胞鉴定，至5～6代之后可将细胞进行提取，置入液氮冷冻箱中保存。

2 结果

2.1 ADSCs的形态学观察 胶原酶消化法培养原代ADSCs 24 h后就有少量细胞贴壁，细胞呈梭形、三角形或多边形，多为单细胞核，首次换液后细胞生长迅速。7 d后可见细胞逐渐变圆，三角形逐渐消失，细胞大多成长梭形。悬浮法48 h后，可见少量形态以长梭形、圆形为主的细胞。7 d后可见大量长梭形细胞。12 d时，细胞融合达90%，可见大量类成纤维样细胞呈漩涡状生长，初步判断所获得的细胞为ADSCs（图1、图2、图3、图4）。

图1 胶原酶法培养第3天的ADSCs（400×）

图2 悬浮法传代培养第3天的ADSCs（400×）

图3 胶原酶消化法培养第7天的ADSCs（400×）

图4 悬浮法传代培养第7天的ADSCs（400×）

2.2 细胞生长曲线 胶原酶法获得的细胞在接种的1～3 d缓慢增长，4～7 d进入快速增长期，之后细胞增长进入平台期，整体生长曲线成“S”形。悬浮法所得细胞在第3 d进入生长暴增期，第7 d进入生长平台期，生长曲线也大体呈“S”形（图5）。

图5 酶消化法与悬浮法的ADSCs生长曲线图

2.3 干细胞的诱导分化能力

2.3.1 干细胞成骨分化能力 分别取酶消化法及悬浮法培养的第3代ADSCs在成骨诱导培养液（完全培养基＋50μg·mL-1L-抗坏血酸＋10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠＋0.1μmol·L-1地塞米松）培养，每2 d换液1次。ADSCs成骨诱导7 d左右，悬浮法及酶消化法均可见细胞体积逐渐增大，呈重叠生长，且形态慢慢变为多边形。诱导3周左右，吸出培养基，用PBS清洗3次，4℃下用70%乙醇固定1 h，室温下用2%的茜素红染色10 min，倒置显微镜下观察，两种方法所诱导的茜素红染色无明显差异（图6）。

图6 两种培养法SDSCs成骨分化诱导能力（茜素红染色，400×）

2.3.2 干细胞成脂分化能力 取酶消化法及悬浮法培养的第3代ADSCs在成脂诱导培养液（完全培养基＋200μmol·L-1吲哚美辛＋0.5 mmol·L-13-异丁基-1-甲基黄嘌呤＋1μmol·L-1地塞米松＋10μg·mL-1胰岛素）培养，每2 d换液1次。成脂诱导7 d左右，细胞体积增大，逐渐变圆，细胞核周围可见少量小脂滴，并随着时间的推移不断融合。培养3周后，吸出培养基，用PBS液冲洗3次，室温下加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，再用PBS冲洗3次，加入油红O染液，室温避光染色30 min，PBS冲洗3次，倒置显微镜下观察。悬浮法及酶消化法的油红O染色无明显差异（图7）。

图7 两种培养法SDSCs成脂分化诱导能力（油红O染色，400×）

3 讨论

ADSCs是间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）的一个亚群，可以比较便利的从脂肪组织中获取，并具有许多与MSCs相同的特性及功能。ADSCs能在体外扩增，并快速繁殖，具有向多种细胞系分化的能力，例如分化为脂肪、骨、软骨和肌源性等细胞。此外，ADSCs还可分化为心肌、平滑肌、内皮、上皮、肝和神经源性等细胞［8-9］。随着医学的发展，细胞治疗的兴起，ADSCs将在美容、康复等领域拥有巨大的潜能。ADSCs有很多提取方法，刘琴等［10］对其分离提取方法进行总结，主要有酶消化法、组织块贴壁法、酶消化法结合组织块贴壁法、悬浮培养法及机械分离方法（涡旋离心法、吸附柱法、超声处理法）等。本文使用了酶消化法及悬浮组织块培养法作对比，比较了两种方法的优缺势，得出结论：两种方法均成功获取大鼠的ADSCs。但与酶消化法相比，悬浮组织块法具有一定的优势：①操作更为简单，酶消化法需要更为精细处理所分离的脂肪组织，而悬浮组织块法只需将其处理成绿豆大小即可。②价格较为低廉，悬浮法无需胶原蛋白酶进一步处理，而改用胰蛋白酶，此举大大降低了实验成本。③此法可克服胶原酶消化法过度消化的问题。④此法可提升脂肪组织利用率。⑤悬浮组织块法接种简单，只需轻轻晃动培养皿即可成功接种。但是在采用悬浮组织块法分离培离ADSCs时有两点注意的事项：①一个约6 cm的培养皿需要加入5～6 mL的培养液让脂肪组织块充分悬浮起来。②成功培养出ADSCs的关键是每皿中放适量的脂肪组织块，如一个6 cm培养皿接种6～8块4～5 mm3大小的组织块即可，接种过多或过少实验均不易成功。总的来说悬浮组织块法对比酶消化法操作更简便，价格更低廉，更具有可行性，但悬浮组织块法更易遭受污染，需较严格把控组织块接种量、培养液的使用及更换。本次实验对比了酶消化法及悬浮组织块法的优缺势，得出结论：对于获取大鼠的ADSCs来说，我们可优先考虑悬浮组织块培养法。