油菜菌核病拮抗内生菌的筛选及其生防效果研究

陈 娴，李咏梅，曾 艳，伍善东，刘冬华

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

油菜是我国重要的油料作物，是湖南省仅次于水稻生产面积的第二大农作物，种植面积和菜籽产量均位居全国前列[1-2]。油菜的生长周期较长，病害种类较多，有菌核病、病毒病、白锈病、黑斑病等[3-4]。其中，危害最严重的是油菜菌核病，该病在我国各油菜产区均有发生。油菜菌核病是由核盘菌感染引发的一类土传病害，其危害导致的减产量约占总病害减产量的80%，严重影响油菜产量和品质[5]。长期以来，油菜菌核病的防治主要是喷施化学杀菌剂，如苯并咪唑类杀菌剂。随着药剂的常年使用，残留的药剂会对环境产生污染；同时，部分核盘菌对这类化学药剂产生了明显的抗药性，从而导致药剂的防治效果越来越差[6-7]。随着人们对生态环保、食品安全的重视，利用生物法防治农作物病虫害已成为目前人们关注的热点。

植物内生菌是一类能够定殖在健康植物组织内部而对宿主植物不造成明显病害症状的一类微生物。内生菌从植物体获取生存空间、营养的同时，也会给植物带来一些生长上的优势，如促进植物生长、提高植物抗病能力等[8]。随着绿色农业的兴起，我国科学界对植物内生菌的研究和应用逐渐增加[9]。已有研究表明，枯草芽孢杆菌BY-2[10]、多粘类芽孢杆菌SF4[11]、芽孢杆菌Y171004、Y177002[12]等油菜内生菌对核盘菌有抑制效果。根据文献检索，目前可用来防治油菜菌核病的内生拮抗菌种类仍然较少，且未见有进入田间实际应用的微生物菌剂的报道。为了寻求效果优良的油菜菌核病生防菌株，研究从油菜植株中分离得到1 株高效的拮抗菌1-4，并进行了菌种鉴定，初步探讨了该菌对菌核病的防治效果，丰富了油菜菌核病内生拮抗菌菌种资源，为进一步开展田间试验提供了基础和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株油菜内生菌：由实验室从健壮油菜根、茎的韧皮部分离得到。核盘菌ACCC 37701（源自油菜）由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所提供。

1.1.2 培养基（1）PDA 加富培养基：土豆（煮汁）200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨2.0 g/L，牛肉膏2.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，琼脂18 g/L，自然pH 值。（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 值 7.0。加入18 g/L的琼脂即为固体培养基。

1.2 试验设计

1.2.1 油菜内生菌的分离纯化采集健壮的油菜植株，用清水将根部泥沙洗干净，削取白色健壮无斑的根须和韧皮部。用75%的酒精浸泡消毒12 min，无菌水浸泡洗涤6 次；再用0.2%的HgCl2浸泡消毒18 min，无菌水浸泡洗涤9 次，第9 次的浸泡洗涤水留下作为对照。将油菜根须和韧皮部放入无菌碾钵中加入适量无菌水碾磨成浆，取浆液进行梯度稀释（10-1～10-5）。从各稀释梯度液中吸取200 μL 涂布到PDA 加富培养基平板上，28℃恒温培养5 d 后，挑取不同形态的单个内生菌落，在平板上采取四分区划线法纯化3～4 次，将纯化后单菌落利用试管斜面低温保存待用。

1.2.2 核盘病菌拮抗菌株的筛选（1）平板对峙法初筛：将直径为1 cm 的油菜核盘菌接种到PDA 加富平板（直径9 cm）的中心，将所有分离的内生菌接种到距离平板中心2.5 cm 处，以不接种内生菌的平板为对照，28℃恒温培养，每个处理重复3 次。待对照组核盘菌长满平板时，测量各内生菌产生的抑菌圈直径，选出具有拮抗效果的内生菌进行复筛。（2）牛津杯法复筛：将直径为1 cm 的油菜核盘菌接种到PDA 加富平板（直径9 cm）的中心，在距核盘菌菌丝扩展的外缘呈等边三角形放置3 个牛津杯，再将培养5 d 的拮抗菌菌液加入至牛津杯中，每处理重复3 次。将平板置于28℃恒温培养3 d，观察抑菌圈并用游标卡尺测量记录其直径。

1.2.3 拮抗菌1-4的菌种鉴定（1）形态学观察、生理生化鉴定：将效果最佳的拮抗菌1-4 接种在牛肉膏蛋白胨平板上，培养3 d 后观察其菌落形态特征和显微形态特征。参照《常见细菌系统鉴定手册》中操作说明，对拮抗细菌1-4 进行生理生化鉴定。（2）16S rDNA 序列分析：用细菌基因组DNA 提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取菌株1-4的基因组DNA，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′）进行16S rDNA 序列的扩增。PCR 反应条件：95℃预变性4 min；95℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s，30 个循环；72℃延伸10 min，4℃终止。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒纯化回收，送上海生物工程有限公司测序。测序结果在NCBI 数据库中进行Blast 比对，利用Mega 5.0 软件中Neighbor-joining 方法构建系统发育进化树。

1.2.4 拮抗菌1-4对油菜菌核病的盆栽防治效果接种拮抗菌1-4 到牛肉膏蛋白胨液体培养基发酵培养72 h，稀释发酵液活菌数至1.0×108CFU/mL 制成菌悬液，待用。将菌悬液以4℃，8 000 r/min 离心15 min，取上清液并用0.22 μm 的细菌过滤器过滤，制成无菌发酵液待用。该试验所用油菜品种为甘蓝型油菜湘油15，在每个小号培养盆中种植一株，待油菜长至5～8片叶时，分别将菌株1-4 的菌悬液和无菌发酵液均匀喷施于叶片表面，30 min 后接种直径5 mm 的油菜菌核病菌菌丝块，置于25℃左右人工气候箱中保湿培养（光照/黑暗=16 h/8 h），以喷施无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基处理的叶片为对照。每个处理重复5 株，2 片叶/株，1 个菌丝块/片叶，重复3 批次。当对照叶片上出现病斑时以及出现病斑2 d 后分别统计发病情况。记录各处理发病植株数及发病严重度，根据公式（1）和（2）计算病情指数和防治效果。病害严重度分级标准：0 级表示无病；1 级表示病斑面积占全叶10%以下；2 级表示病斑面积占全叶10%～30%；3级表示病斑面积占全叶31%～50%；4 级表示病斑面积占全叶51%以上[13]。

1.3 数据分析

采用Excel 2003 软件计算试验数据的平均值和标准差，并进行绘图；利用SPSS 18.0 软件进行单因素方差（ANOVA）统计分析，采用Duncan 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 油菜菌核病内生拮抗菌的筛选

根据菌落形态、颜色、边缘等特征对油菜内生菌比较去冗余后，利用PDA 加富培养基共分离出72 株内生菌。用平板对峙法进行初筛后，发现有6 株菌株对核盘菌有抑制作用。牛津杯法复筛结果（图1）表明，菌株1-4、7-3 抑菌圈直径较大，其中菌株1-4 对油菜核盘菌的抑制能力最强。采用连续传代法对菌株的遗传稳定性进行检测，结果如图2 所示，菌株1-4 发酵液的抑菌活性在传代过程中无显著改变，说明其遗传稳定性好。因此，选择该菌株进行下一步研究。

图1 筛选出的拮抗内生菌对核盘菌的抑菌效果

图2 菌株1-4 抑菌能力的遗传稳定性

2.2 菌株1-4 的菌种鉴定

菌株1-4 在牛肉膏蛋白胨平板上形成的菌落呈圆形，表面粗糙，边缘不整齐，无色素产生；在油镜下，菌体为中等长度杆状，单生，产芽孢（图3），革兰氏染色呈阳性。菌株的生理生化试验结果如表1 所示，这些生理生化特性与《伯杰氏细菌鉴定手册》中对地衣芽孢杆菌的描述一致。

图3 菌株1-4 的菌落形态及显微形态特征（×1 000 倍）

表1 菌株1-4 的生理生化试验结果

PCR 扩增获得菌株1-4 的 16S rDNA 序列长度为 1 430 bp（Genbank 登录号：MZ520363），将其与NCBI 数据库中已有序列进行BLAST 比对，菌株与Bacillus licheniformisDSM 13 的相似性较高，基于其16S rDNA 序列构建的系统发育树如图4 所示。结合菌株形态学特征、生理生化特征和系统进化树分析的结果，可确定菌株1-4 为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

图4 基于菌株16S rDNA 序列构建的系统发育树

2.3 菌株1-4 对油菜菌核病的盆栽防治效果

盆栽试验结果（表2）显示，试验48 h 时，菌株1-4 的菌悬液和无菌发酵液处理组的油菜菌核病病情指数均显著低于对照组，防治效果分别为84.84%、76.07%，说明菌悬液和无菌发酵液处理对油菜菌核病均有显著抑制效果。试验96 h 时，各处理组油菜的病情指数不断增大，菌悬液、无菌发酵液处理的防治效果分别为78.22%、69.95%，比之前有所降低，但仍具有较好的防治效果。试验结果还显示，菌悬液处理的防治效果显著高于同时期无菌发酵液处理，说明活菌体才是防治效果发挥的根本原因。

表2 菌株1-4 对油菜菌核病的盆栽防治效果

3 结 论

该研究从健壮油菜植株内分离得到72 株内生菌，通过平板对峙法和牛津杯法筛选到6 株对油菜菌核病致病菌核盘菌具有拮抗活性的内生菌。其中，菌株1-4对核盘菌的抑制作用非常显著，且经过连续传代培养后，其抑菌特性能够稳定遗传。结合形态学特征、生理生化特性及16S rDNA 序列分析，将菌株1-4 鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。盆栽试验结果表明，该菌株的菌悬液和无菌发酵液均对油菜菌核病有较好的防治效果，且菌悬液处理的防效优于无菌发酵液。

4 讨 论

目前，科技工作者主要从农作物根际土壤微生物和作物内生菌中筛选病虫害生防菌。相对于根际土壤微生物，作物内生菌是一类与植物互惠共生的微生物，可以提高作物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力，生物安全性高。地衣芽孢杆菌是一种广泛应用的生防菌，对稻瘟病菌、轮纹病菌、青霉病菌、枯萎病菌等具有一定的防效。据统计（截至2020 年9 月），地衣芽孢杆菌在7 051 种登记的微生物菌肥产品中的应用频次为1 517 次，应用率为21.51%，应用非常广泛[14]。该类生防菌的安全性高、生长快、抗逆能力强，故该试验筛选获得的拮抗菌1-4 具有良好的应用前景。

拮抗菌1-4 的无菌发酵液对油菜菌核病也有显著的防治效果，说明其在发酵过程中产生了某些抑制核盘菌生长的物质。孙启利等[15]研究发现，地衣芽孢杆菌W10 产生的抗菌蛋白可显著抑制病菌的生长，而菌株1-4 是否也可产生类似的抗菌蛋白，有待进一步研究。该试验中，菌悬液处理的防治效果显著优于同时期无菌发酵液处理，其原因可能是菌悬液中的活菌体能够在油菜上定殖，循环产生拮抗物质[10]。