解淀粉芽胞杆菌TS-12 03对苹果炭疽叶枯病菌的抗生作用

朱娜　张树武　徐秉良等

中图分类号：S 436. 611. 12 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2020174

苹果炭疽叶枯病（Glomerella leaf spot）是苹果树近年来严重发生的一种病害。1988年，Leite等首次报道该病害是由病愿菌有性态围小丛壳Glomerella cingulata，无性态胶孢炭疽菌Colleto trichum gloeosporioides引起。该病害主要发生在‘金冠‘嘎啦和‘乔纳金等苹果品种的叶片上，還可危害‘金冠‘富士和‘秦冠等品种的果实。同时，该病害的病原菌寄主范围较广，可侵染1000多种植物，发生严重时可导致苹果树叶片快速干枯脱落，果面形成大量褐色圆形小斑点，导致严重减产和经济损失。目前，国内外有关苹果炭疽叶枯病的防治已有报道，主要以化学防治为主。宋梁栋等研究发现波尔锰锌与代森锰锌对苹果炭疽叶枯病防效理想。韩文启等发现波尔多液，溴菌腈与甲基硫菌灵与吡唑醚菌酯对苹果炭疽叶枯病具有很好防效。但随着化学药剂长时间的大量使用，病原菌抗药性的产生，导致防治效果大幅降低。Spalding等研究发现芒果炭疽菌对苯菌灵产生高水平抗性;陈聃等报道浙江省葡萄炭疽菌Colleto trichum gloeosporioides对甲基硫菌灵与乙霉威产生了严重的抗性。同时，化学杀菌剂的长期大量使用造成的农药残留和生态环境污染问题也很严重。

鉴于化学防治存在的不足，急需寻求安全且对苹果炭疽叶枯病高效的防治措施。因此，生物防治已成为国内外苹果炭疽叶枯病防治研究的新趋势。张颖等研究表明，水杨酸可通过提高叶片中防御酶活性以及调节SA信号途径相关基因的表达量，诱导‘嘎啦苹果叶片对炭疽叶枯病的抗性。朱学明等的研究结果表明，内生放线菌A-1对苹果炭疽叶枯病的防效达70. 42%，但是目前应用生防菌对苹果炭疽叶枯病的防治主要集中于诱导寄主产生抗病性，而且报道较少。因此，本试验通过生防菌株解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌菌落及孢子萌发抑制作用的室内和离体测定，旨在为苹果炭疽叶枯病的生物防治提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试病原菌和生防菌：苹果炭疽叶枯病菌Glomerella cin.gulata和解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens（TS-1203）均由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室提供。

1.2试验方法

1.2.1 TS-1203菌液与发酵液制备

参考侯宝宏等的方法。将NA培养基上活化24 h的TS-1203菌株取一环接种于100 mL NB培养液中，置于黑暗，28℃，180r/min振荡培养12 h后获得种子液。取5 mL种子液接种于无菌NYBD培养基中，置于黑暗，28℃，180r/min振荡48 h后得到菌液。发酵产物经4℃ 10000r/min，离心30 min，2次离心后将上清液用无菌的微孔滤膜过滤器（孔径0. 22μm）过滤2次，最终获得液体为发酵液无菌原液，4℃保存待用。

1.2.2 TS-1203菌液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制作用

采用滤纸片扩散法测定TS-1203菌液对苹果炭疽叶枯病菌抑制活性。将直径为5 mm的滤纸片经121℃灭菌25 min后干燥备用。然后，将经灭菌的滤纸片置于TS-1203菌液中浸泡，待其完全浸湿后置于无菌超净工作台中晾干备用。同时，将25℃光照条件下培养5d的苹果炭疽叶枯病菌菌饼（d=0.5 cm）接种于PDA培养基中央，沿菌饼四周等距离（距菌饼2cm处）放置4个浸有菌液的滤纸片，并置于25℃，L∥D=16 h∥8h光照培养箱中培养。试验以等距离浸有等量无菌水的滤纸片作为对照，且每个处理和对照均为3个重复。培养24、48、72、96 h后采用“十字交叉法”测定苹果炭疽病菌的菌落直径，并计算其抑菌率。培养96 h后，挑取处理和对照中的苹果炭疽病菌的菌丝，比较和观察其形态特征。

抑菌率=对照菌落直径-处理菌落直径/对照菌落直径-0.5×100%。

1.2.3不同浓度rlrS-1203发酵液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制作用

采用菌落生长速率法测定。取0.1、0.2、0.5、1、2、3 mL发酵原液，分别加入19.9、19.8、19.5、19、18、17 ml_未冷却的PDA中，其终浓度分别为0. 5%，1%、2.5%、5%、10%、15%。在病原菌菌落边缘打取菌饼（d=0.5cm）将其接种于上述培养基中央，在25℃下光照培养。以加入与发酵原液等量无菌水的PDA培养基为对照，每处理3次重复。培养Sd后采用十字交叉法测量菌落直径，计算其抑菌率。

1.2.4 TS-1203发酵液对苹果炭疽叶枯病菌孢子萌发的影响

用无菌水将炭疽叶枯病菌的分生孢子配制成1×10⁶个/ml_的孢子悬浮液备用。然后，将孢子悬浮液与发酵原液按1：1的比例混匀，取60μL均匀涂布于水琼脂培养基，置于25 0C光照培养箱中培养，以孢子悬浮液与无菌水按1：1的比例混匀为对照，分别于处理后6、12、18、24h观察分生孢子形态，计算萌发抑制率及芽管生长抑制率。试验共设置3个重复，每个重复观察5个视野。

1.2.5 TS-1203发酵液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制作用

选取‘富士苹果树枝条前端完全展开的叶片，用1%次氯酸钠溶液进行表面消毒30s，无菌水冲洗2～3次，在超净工作台上自然晾干，用滴有无菌水的无菌脱脂棉包裹叶柄基部。于叶面（直径5 mm的圆形区域内）采用“针刺法”进行伤口处理，刺伤部位避开叶片主脉，将发酵液均匀涂抹在叶片表面待风干后将培养好的苹果炭疽叶枯病菌菌饼（d=5 mm）接种于伤口处，试验设无菌水处理作为对照，每个处理3个重复，于25℃光照培养箱中培养，接种后观察病斑扩展情况。接种5d后采用“十字交叉法”测量病斑大小，并计算抑制率。

抑制率=对照病斑直径-处理病斑直径/对照病斑直径×100%。

1.3数据处理

采用Excel 2010软件对数据进行统计分析，并采用SPSS软件和Duncan氏新复极差法进行多重比较。

2结果与分析

2.1 TS-1203菌液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制作用

与对照相比，TS-1203菌液对苹果炭疽叶枯病菌具有显著的抑制作用（图1）。处理24h时，TS-1203菌液对苹果炭疽叶枯病菌的抑菌率为62. 5%，随着时间延长抑菌率显著增加，处理96 h的抑制率为70.4%（表1），苹果炭疽叶枯病菌菌落生长至靠近滤纸片后菌丝停止向滤纸片方向生长（图1a和b），而对照菌落生长正常，近乎长满整个培养皿（图1c和d）。

培养96 h后挑取处理组菌丝及对照菌丝观察发现，对照菌丝生长正常（图2a），而TS-1203菌液处理组菌丝出现畸形膨大（图2b）和部分消解断裂（图2c）。

2.2不同浓度TS-1203发酵液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制作用

不同浓度TS-1203发酵液对苹果炭疽叶枯病菌生长具有显著的抑制作用，而且随着浓度的增加其抑制作用显著增加（图3）。与对照相比，经浓度为0.5%、1%、2.5%、5%、10%、15%的TS-1203发酵液处理5d后的病原菌菌落直径均显著小于对照，随着浓度增加其菌落直径显著减小，不同浓度之间存在显著差异。当TS-1203发酵液浓度为15%时，对苹果炭疽叶枯病菌抑菌率最高，为59.0%（表2）。

2.3 TS-1203发酵液对苹果炭疽叶枯病菌孢子萌发及芽管长度的影响

TS-1203发酵液对苹果炭疽叶枯病菌分生孢子萌发和芽管的生长具有明显的抑制作用。显微观察发现，发酵原液处理6h后分生孢子开始萌发，但芽管的生长受到显著抑制（图4A），而无菌水对照处理的孢子芽管长度是发酵原液处理的2倍（图4a）。发酵原液处理12h后，孢子与对照处理（图4b）相比芽管生长缓慢（图4B）。随着处理时间增加，发酵液处理与无菌水处理的孢子萌发率和芽管长度均增加，但发酵原液处理18 h后，病原菌的芽管明显受到了抑制（图4C），而对照芽管生长正常（图4c）。发酵原液处理24h后，病原菌芽管出现粗细不均、生长缓慢的现象（图4d），而无菌水处理的芽管生长速度较快且生长正常（图4d）。

处理6、12、18和24 h后，发酵原液对病原菌孢子萌发的抑制率均高于60%，其中处理6h的孢子萌发抑制率最低，为66. 7%;处理12h和18 h的孢子萌发抑制率分别为68. 2%和72.4%，处理24 h后孢子萌发抑制率最高，达78. 2%（表3）。随着处理时间增加，对芽管生长抑制率逐渐增大，处理24h后芽管生长抑制率最高，为64. 3%（表4）。

2.4 TS-1203發酵液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制作用

经TS-1203发酵液处理的苹果离体叶片接种炭疽叶枯病菌后保湿培养3d后，苹果叶片均未出现明显病斑，5d后苹果叶片发病但病斑面积较小，且扩展缓慢。而以无菌水作为对照处理的苹果叶片发病较快，接种3d后叶片出现褐色病斑，发病率为100%，5d后出现不规则形褐色坏死斑，病斑直径为18.4 mm;TS-1203发酵原液处理组发病轻且缓慢，5d后病斑直径仅5.5 mm（图5，表5）。同时，与对照相比，处理5d后，TS-1203发酵原液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制率高达70.1%（表5）。

3讨论

解淀粉芽胞杆菌Bacillus

amylolique faciens-是一种安全且对逆境条件有良好耐受力和抵抗力的菌株，它与枯草芽胞杆菌极为相似，可作为根围有益菌促进植物生长。同时也可以产生抗生素和抑菌蛋白等活性物质抑制植物病原菌。陈成等报道解淀粉芽胞杆菌HN06对黑曲霉Aspergillus niger、稻瘟菌Magnaporthe oryzae、水稻纹枯菌Rhizoctonia solani和苦瓜枯萎病菌Fusarium orysporum f.sp.momdicae均有良好的抑制作用。陈士云等研究发现解淀粉芽胞杆菌菌株CH-2不仅可以抑制油菜核盘菌Sclerotinia sclerotiorum菌丝的生长，而且能抑制菌核的形成。解淀粉芽胞杆菌的抑菌机理主要包括抑制菌丝生长使其菌丝畸形消融、变细，原生质体渗漏，以及抑制孢子萌发。

关于解淀粉芽胞杆菌的抑菌作用，刘超等报道解淀粉芽胞杆菌菌株BA-26使灰葡萄孢Botrytiscinerea菌丝生长受阻、膨大变粗、并能抑制其孢子萌发。本研究发现解淀粉芽胞杆菌TS-1203菌液对苹果炭疽叶枯病菌具有显著地抑制作用（70.1%）;显微观察发现病原菌菌丝出现畸形、膨大、缢缩、断裂等现象，表明解淀粉芽胞杆菌TS-1203可通过接触病原菌菌丝使其菌丝不能正常生长从而达到抑制病原菌的作用。TS-1203发酵液对苹果炭疽叶枯病菌的孢子萌发以及芽管生长均具有显著的抑制作用，且抑制率随着发酵液浓度的增加而上升。不同时间段显微观察发现，TS-1203发酵液可导致病菌分生孢子萌发时间延迟、萌发率降低，芽管畸形、生长缓慢。随着萌发时间的延长，孢子的萌发抑制率与芽管的生长抑制率也显著增加。说明菌株TS-1203发酵液可通过抑制病原菌的孢子萌发及生长达到抑制病原菌的目的。李扬等发现解淀粉芽胞杆菌ZJ01对枣黑斑病菌Alternaria alternata的抑制率达到53. 3%，且发酵液处理过的病原菌菌丝出现了顶端膨大、原生质割裂、孢子萌发受抑制等现象。

另外，在芽胞杆菌对病斑扩展的抑制作用研究中，纪兆林等发现地衣芽胞杆菌Bacillus lichen-iformis W10对炭疽病菌菌丝生长、分生孢子萌发都有明显的破坏或抑制作用，且对病斑扩展具有明显的抑制作用。本试验中TS-1203发酵液处理苹果树离体叶片并接种病原菌后发病迟缓且发病较轻，说明解淀粉芽胞杆菌可以有效地抑制植物病原菌的侵染并对离体叶片上的病斑扩展有显著的抑制作用。

因此，本试验研究发现解淀粉芽胞杆菌TS-1203菌株及其发酵液对苹果炭疽叶枯病菌具有显著的抑制作用，研究结果为后期的生物防治提供了基础，但是对TS-1203菌株的抑菌机理和抑菌活性物质的研究及TS-1203菌株在田间防治苹果炭疽叶枯病尚需进一步研究。