16S与gyrB基因联合建树快速鉴定一株蜡样芽孢杆菌

傅 奇，甘美裕，王 艳，林俊杰，卢源钦，肖玉娟

（厦门华厦学院，福建 厦门 361024）

作为细菌鉴定最常用的方法，16S rDNA/RNA测序具有快速、简便、准确等优点，但在部分类群中16S序列存在高度相似性，无法准确定位到种[1]。尤其在芽孢杆菌属中，由于种间序列高度相似，无法单独依靠16S序列对菌种进行鉴定，通常需要结合其他数据进行分析，如通过3′端16S rDNA和5′端16S-23S ITS核苷酸序列结合构建进化树进行分类[2]，再结合 DNA 杂交进行分析[3]；或 16S、gyrA、gyrB基因序列分别比对、建树[4]。

蜡样芽孢杆菌作为一种条件致病菌，可产生多种毒素，导致腹泻或呕吐[5]，是食品中的一类重要致病菌，施用动物肥的果蔬容易受污染。目前蜡样芽孢杆菌主要通过生化实验进行鉴定，耗时较长，开发快速准确的分子鉴定方法有助于缩短检测周期。gyrB基因作为一种细菌中的常见保守序列，可编码DNA促旋酶的B亚单位，进化速度快于16S，可用于细菌的鉴定[6]。张慧娟等人采用gyrB与多个毒力基因结合进行多重PCR进行快速检测，但其中特异性gyrB基因在部分苏云金芽孢杆菌也呈扩增阳性[7]。本研究利用16S序列与gyrB基因拼接序列联合建树，以较少的序列数和进化树数实现对筛选菌株的快速鉴定，提高数据的利用率，减少数据冲突，为芽孢杆菌种群的分子生物学鉴定方法开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样本 厦门同安国家农业科技园区竹坝农场采集，该种植区施用动物肥。

1.1.2 培养基 营养琼脂培养基：购自广东环凯生物科技有限公司；甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基、胰酪胨大豆羊血琼脂培养基、动力-硝酸盐培养基：购自青岛海博生物科技有限公司。

1.1.3 PCR反应 细菌基因组DNA提取试剂盒：购自生工生物工程（上海）股份有限公司；16S扩增引 物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（F），5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′（R）；gyrB 扩 增 引物 ：5′-ATTTGG CGCTGGCGGTTAT-3′（F），5′-GGTTTCGGCTGGGC TGGTA-3′（R）：购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 于农场施用动物肥的蔬菜种植区采集土壤，取土壤25 g加入225 mL蛋白胨生理盐水稀释均质后涂布营养琼脂平板，30℃培养24 h，取疑似芽孢杆菌的单菌落进行划线纯化。

1.2.2 16S与gyrB序列提取 用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离纯化菌株的总DNA；分别用16S与gyrB引物扩增，所得PCR产物电泳纯化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.3 16S与gyrB序列比对与进化分析 将16S与gyrB基因测序所得结果在Genbank进行比对。为保障数据的准确性和有效性，避免错误信息干扰，选择Genbank中gyrB相似度前1 000个序列中的ATCC菌株进行比对，且选择16S与gyrB序列同时可得的菌株进行比对。16S与gyrB基因序列用BioEdit[8]进行比对，去除两端不整齐序列，用ClustalX[9]进行格式转换后，取有效区间拼接[10]，用Paup*4.0基于最大简约算法，构建拼接序列进化树[11-12]，选择大肠杆菌ATCC 25922[13]作为外群。

1.2.4 生理生化验证 参考国标《饲料中蜡样芽孢杆菌的检测》[14]和《伯杰细菌鉴定手册》[15]进行验证。

1.2.5 联合建树方法适用性分析 为分析16S与gyrB基因联合建树的方法是否适用于其他蜡样芽孢杆菌的鉴定，于Genbank下载16S与gyrB基因均可得的蜡样芽孢杆菌序列，按照上述方法进行序列拼接。选择《伯杰细菌鉴定手册》[14]中芽孢杆菌属模式菌株，于Genbak和和EZBiocloud下载16S和gyrB序列，选择大肠杆菌ATCC 25922作为外群，构建进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株分离纯化

从土壤中筛选得到一株革兰氏阳性杆菌，菌落呈灰白色，细胞成链状排列，编号为HX2016002。

2.2 16S与gyrB基因测序

PCR扩增所得16S序列有效区共1 439 bp，gyrB序列有效区共1 386 bp。

2.3 序列比对与进化树构建

16S序列比对结果中，高相似度菌株过多，且多数菌株无gyrB序列；而gyrB序列比对结果中，高相似菌株远少于16S比对结果，且多数菌株同时可获取16S序列，因此，以gyrB相似菌株作为建树群，其中ATCC菌株均为全基因组测序，因此16S与gyrB基因序列号相同，见表1。

表1 Genbank中拥有相似16S与gyrB序列的菌株Table 1 Strains in Genbank with similar 16S and gyrB sequences

16S和gyrB序列比对后去除头尾不整齐片段，均保留中心区域1 335 bp，将同一菌株的16S与gyrB拼接后建树，见图1。计算次数为1 000，树长为5 680，一致性指数（CI）为 0.685，保留指数（RI）为 0.754，同型指数（HI）为 0.315。

图1 基于16S与gyrB合并序列的进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on merged sequences of 16S and gyrB

全树各分支自展值均高于96，表明该树结构可靠，其中HX2016002与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）聚为一支，自展值为100，表明其很可能为蜡样芽孢杆菌菌株。

2.4 生理生化验证

HX2016002菌株接种至MYP琼脂平板，30℃培养24 h后菌落呈粉红色，周围有晕圈；接种至胰酪胨大豆羊血琼脂，30℃培养24 h后，菌落周围出现溶血环；穿刺接种至动力-硝酸盐培养基，30℃培养24 h后沿穿刺线呈扩散生长；蛋白质结晶毒素染色试验呈阴性。确认该菌株为蜡样芽孢杆菌，与进化分析结果一致，命名为 Bacillus cereus HX2016002。

2.5 联合建树方法适用性

在Genbank中选择符合以下条件的蜡样芽孢杆菌下载16S与gyrB序列：一是16S与gyrB序列均已上传Genbank；二是鉴定结果较为可靠。共有满足条件的菌株52株，另选择亲缘关系较近的芽孢杆菌属其他菌种模式菌株15株，拼接16S与gyrB基因序列后构建进化树，见图2。其中所有的蜡样芽孢杆菌均聚合在一簇，表明如这52株菌中的任意一株菌种在还未鉴定的情况下，利用该方法建树时与其他51株蜡样芽孢杆菌均聚合在一支，可准确鉴定为蜡样芽孢杆菌。16S与gyrB基因联合建树的方法适用于已知的52株蜡样芽孢杆菌鉴定，可以预测该方法在蜡样芽孢杆菌鉴定中具有普适性。

图2 Genbank已知菌株基于16S与gyrB序列的进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of 16S and gyrB in Genbank

3 结 语

芽孢杆菌是生活中常见也是非常重要的一类微生物，研究人员经常需要对其中的某一个或多个菌株进行鉴定，而分子生物学鉴定具有快速、简便且准确的优点，是目前常用的菌种鉴定手段，但芽孢杆菌之间保守序列的高度相似性为分子生物学鉴定带来了困扰，往往需要对多个基因甚至全基因组进行测序来定位到种。在研究过程中，本课题组先通过16S序列将菌株定位至芽孢杆菌分类簇，设计gyrB引物扩增、测序后缩小比对范围。同时，为了保障数据的准确性，避免无效甚至错误数据，选择ATCC保藏的菌株进行分析。本课题组认为，在单基因测序的基础上，单纯的增加测序基因数量并对多个基因分别比对和建树的方法有时并不能提高鉴定的准确性，甚至可能造成分析结果的紊乱和冲突，因此，选择了16S与gyrB基因联合建树的方式进行分析，将HX2016002准确鉴定为蜡样芽孢杆菌。经验证，该方法在蜡样芽孢杆菌的鉴定中具有较普遍的适用性，下一步将继续研究该方法在其他保守序列相似度高的菌群鉴别中应用的有效性。