DeoR家族转录因子PsrB调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素

潘学玮 ，孙长皓 ，尤甲甲 ，徐美娟 ，张 显 ，邵明龙 ，杨套伟 ，饶志明 *

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

灵菌红素（Prodigiosin，PG）作为一种具有3个吡咯环的甲氧基吡咯骨架结构类物质，是一种微生物次级代谢产生的重要天然红色素[1]。研究发现，灵菌红素具有抗细菌、抗疟疾、抗肿瘤和免疫抑制等重要功能，在医药开发、环境治理和染料制备等领域具有巨大的应用价值[2-6]。目前，灵菌红素的制备方法主要包括化学合成法和微生物法。由于化学合成法反应步骤多、产率低，难以实现灵菌红素的大规模生产。而微生物法生产灵菌红素具有环境友好、条件温和、成本低和易于工业化生产等优点，因此近年来微生物法生产灵菌红素已成为国内外研究热点。而自然界中产灵菌红素的微生物种类主要包括：沙雷氏菌属 （Serratia Sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas Sp.）、河氏菌属（Hahella Sp.）、弧菌属（Vibrio Sp.）和海洋新细菌（Zooshikella rubidu）等[7-11]，其中研究最为广泛的为黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens），该菌又被称为灵杆菌，是一种常见的革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、水、植物、昆虫和食品等环境中。

对黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的代谢调控网络研究发现，黏质沙雷氏菌合成灵菌红素受多个基因的共同调控，这些基因可被分为两大类：灵菌红素生物合成途径所必须基因以及编码转录调控因子相关基因。其中，黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的代谢途径见图1。该代谢途径由pig基因簇上14个基因所控制，通过两个分支途径合成灵菌红素，这两个分支途径分别合成灵菌红素的两个前体物质2-甲基-3-戊基吡咯（MAP）和 4-甲氧基-2，2-二吡咯-5-羧甲基乙醛（MBC），两者经缩合酶PigC作用生成灵菌红素。其中，MAP以2-辛烯醛为起始前体，在基因pigD、pigE和pigB的催化下氧化脱氢形成MAP。MBC的合成以L-脯氨酸为起始底物，在基因 pigI、pigG、pigA、pigJ、pigH、pigM、pigF 和 pigN 的作用下生成MBC[12]。在黏质沙雷氏菌中，灵菌红素的合成也受到多个转录调控因子的直接或间接调控，包括灵菌红素合成负调控因子MetR[13]、SpnR[14]和 SmaR[15]，以及正调控因子 EepR[16]、PigP[17]和RbsR[18]。尽管这些基因参与调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素，但是我们对黏质沙雷氏菌合成灵菌红素背后的调控机制的了解依然有限。

图1 黏质沙雷氏菌中灵菌红素合成途径Fig.1 Prodigiosin biosynthesis pathway in S.marcescens

以作者所在实验室先前分离至土壤中的黏质沙雷氏菌JNB5-1为研究对象[13，19]，构建转座子插入突变文库发现，DeoR家族转录调控因子PsrB正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。通过RT-qPCR、融合报告基因的构建及EMSA等实验证实，转录因子PsrB通过直接与黏质沙雷氏菌灵菌红素合成基因簇pig基因簇结合，刺激pig基因簇的转录水平，最终影响黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。该研究探索了黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的调控机制，并为代谢工程改造黏质沙雷氏菌生产灵菌红素提供了一种新的策略。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

黏质沙雷氏菌 （Serratia marcescens）JNB5-1：作者所在实验室先前从土壤中筛选得到[13，19]；K8-61:本研究筛选得到的灵菌红素合成能力显著下降Tn5G转座子插入突变株；ΔPsrB：本研究构建得到基因psrB缺失突变株；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 和 BL21（DE3）：购自生工生物工程（上海）股份有限公司；质粒pUCP18和pDN19lacΩ：作者所在实验室保存；重组质粒pXW1906和pXW1905等：本研究构建。本研究使用的菌株和质粒见表1。

表1 本研究所用的菌株及质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 试剂

质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒：购自上海捷瑞生物工程有限公司；ClonExpress®II One Step Cloning Kit、2×Phanta®Max Master Mix、HiScript®II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）和 ChamQTMUniversal SYBR®qPCR Master Mix：购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit：购自天根生化科技（北京）有限公司；EcoR I、BamH I和Hind III等限制性内切核酸酶：购自宝日医生物技术（北京）有限公司；庆大霉素、氨苄青霉素和硫酸安普霉素等抗生素：购自上海阿拉丁生化科技有限公司；其他试剂：均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 培养基与培养条件

大肠杆菌采用LB培养基（蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0），于37℃下180 r/min进行培养；黏质沙雷氏菌采用LB培养基于30℃下180 r/min进行培养；黏质沙雷氏菌发酵产灵菌红素时，培养基为LB培养基或特定的发酵培养基（蔗糖 20 g/L、牛肉膏 15 g/L、CaCl210 g/L、脯氨酸 7.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L 和 FeSO4·7H2O 0.06 g/L，pH 7.0）。在培养大肠杆菌时，将向培养基中加入终质量浓度为10 μg/mL的庆大霉素、25 μg/mL的硫酸链霉素、25 μg/mL 的壮观霉素、50 μg/mL 的卡那霉素或50 μg/mL氨苄青霉素；培养黏质沙雷氏菌时，将向培养基中加入终质量浓度为50 μg/mL的庆大霉素、25 μg/mL 的硫酸链霉素、25 μg/mL 的壮观霉素、50 μg/mL的硫酸安普霉素或150 μg/mL氨苄青霉素。

1.4 转座子插入突变文库的构建以及突变株SK8-61的筛选

以大肠杆菌E.coli/pRK2013 Tn5G为供体菌，黏质沙雷氏菌S.marcescens JNB5-1为受体菌，利用接合转移的方式构建Tn5G转座子插入突变文库，得到黏质沙雷氏菌Tn5G转座子插入突变文库[13]。突变文库中的突变子经在含抗生素庆大霉素（50 μg/mL）和氨苄青霉素（50 μg/mL）的双抗平板上过夜培养24 h后，观察菌落的颜色，挑取菌落颜色显著下降的突变株作为灵菌红素合成能力显著下降的潜在突变株。然后将这些突变株及野生型菌株JNB5-1接种至LB培养基中进行过夜培养后（16 h），按照体积分数4%接种至新鲜的LB培养基中进行发酵培养，以进一步确定突变株合成灵菌红素能力，最终筛选得到灵菌红素合成能力显著下降的突变株SK8-61。

1.5 突变株SK8-61中Tn5G转座子插入位点的鉴定

突变株SK8-61中Tn5G转座子插入位点的鉴定按照文献[24]的反向PCR方法进行。提取得到菌株SK8-61基因组DNA后，用限制性内切酶TaqⅠ酶切突变株基因组DNA，之后DNA连接酶自连得到环状的DNA片段。然后以环状的DNA片段为模板，利用引物OTn1和OTn2进行反向PCR得到DNA片段。扩增得到的DNA片段经测序后与NCBI数据库进行比对（http：//www.ncbi.nml.nih.gov/），以确定Tn5G转座子的插入位点。为进一步验证被阻断基因的功能，以黏质沙雷氏菌JNB5-1基因组DNA为模板，PsrB-F1和PsrB-R1为引物扩增得到被破坏基因的完整序列并克隆至载体pUCP18上得到重组质粒pXW1906。将重组质粒转移至突变株SK8-61中进行功能互补实验，以证实转录因子PsrB对于黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的重要性。本研究中所用到的引物见表2。

表2 本研究所用到的引物Table 2 Primers used in this study

续表2

1.6 psrB缺失突变株ΔPsrB及psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906的构建

如采用基因替换的方法对菌株JNB5-1的psrB基因进行失活[13]。通过对引物扩增得到靶基因psrB基因的上下游片段和aacC3抗性基因的DNA片段。通过重叠延伸PCR将aacC3基因整合到目标基因上下游片段的中间，然后将该PCR产物克隆至pUTKm载体中得到重组质粒pUTKm-PsrB。将得到的质粒pUTKm-PsrB转化至大肠杆菌S17-1中得到重组菌株S17-1/pUTKm-PsrB。最后以大肠杆菌E.coli S17-1/pUTKm-PsrB为供体菌、黏质沙雷氏菌JNB5-1为受体菌，通过接合转移的方法对黏质沙雷氏菌JNB5-1的psrB基因进行敲除。psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906的构建方法，是将构建得到的携带有psrB基因的重组质粒pXW1906导入至菌株JNB5-1中得到重组菌株JNB5-1/pXW1906。

1.7 生长曲线的测定

测定菌株 JNB5-1、SK8-61、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB、ΔPsrB/pXW1906 及 JNB5-1/pXW1906的生长曲线。对数生长期细胞（OD600=0.8）转接至新鲜的液体LB培养基中，于30℃、180 r/min下连续培养，每隔 0、2、4、6、8、10、12、24 h 检测培养液的光密度A600nm，绘制得到菌株 JNB5-1、SK8-61、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB、ΔPsrB/pXW1906 及 JNB5-1/pXW1906的生长曲线[13]。

1.8 RNA的提取和RT-qPCR

为验证转录因子PsrB对黏质沙雷氏菌灵菌红素合成基因簇pig基因簇基因表达水平的影响，将过夜培养的黏质沙雷氏菌野生型菌株JNB5-1及psrB突变株ΔPsrB，以4%的接种体积分数分别接种于新鲜的液体LB培养基中，于30℃、180 r/min培养 12 h，取 1 mL样品用 RNAprepPure Cell/Bacteria Kit（DP430）试剂盒（TiangenBiotech，China）提取样品总 RNA，然后利用 HiScript®II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（R223-01）试剂盒（Vazyme Biotech，China）对RNA进行反转录获得cDNA，再利用StepOnePlus荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）进行 RT-qPCR 分析，以分析基因pigABCDEFGHIJKLMN在菌株JNB5-1及SK8-61中的表达水平。RT-qPCR具体操作参照ChamQTMUniversal SYBR®qPCR Master Mix（Q311）试剂盒说明书进行，反应条件为：95℃预变性30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共 40个循环，然后 95℃ 15 s，60℃60 s，95℃ 15 s。每个目的基因均进行3次生物学重复，计算平均阈值循环。编码16S rDNA的基因被作为内参基因进行定量，最后使用2-ΔΔCt方法计算相对表达水平。

1.9 转录融合报告基因的构建

参考文献[25-26]的方法构建转录融合报告基因[25-26]。首先根据黏质沙雷氏菌UMH8基因组序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP018927.1），设计引物PigA-F和PigA-R，以黏质沙雷氏菌JNB5-1基因组DNA为模板，扩增得到携带有pig操纵子启动子区域的DNA片段，然后将该DNA片段连接至载体pDN19lacΩ中得到重组质粒pXW1905。重组质粒pXW1905转化E.coli DH5α感受态细胞，在含硫酸链霉素（50 μg/mL）和壮观霉素（50 μg/mL）的双抗平板上筛选得到转化子。提取转化子中的质粒，经EcoR I和BamH I双酶切后验证重组菌株E.coli DH5α/pXW1905是否构建成功。为检测野生型菌株JNB5-1及psrB缺失突变株SK8-61中pig基因簇的表达差异，重组质粒pXW1905将通过电转的方式分别转移至菌株JNB5-1及SK8-61中得到重组菌株JNB5-1/pXW1905和SK8-61/pXW1905。为体内证实转录因子PsrB与pig基因簇启动子区域间的直接相互作用，质粒pXW1906和pUCP18将分别转移至菌株E.coli DH5α/pXW1905中，得到重组菌株E.coli DH5α/pUCP18/pXW1905 和 E.coli DH5α/pXW1906/pXW1905。

1.10 β-半乳糖苷酶酶活的测定

将过夜培养的菌株S.marcescens JNB5-1/pXW1905 和 SK8-61/pXW1905、E.coliDH5α/pUCP18/pXW1905和 DH5α/pXW1906/pXW1905分别转接至新鲜的液体LB培养基，30℃或37℃振荡培养至A600nm为3.0，按照标准的Miller方法检测由lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶酶活，即取上述菌液于试管中，向试管中加入80 μL质量分数0.1%SDS，80 μL 氯仿，3 mL Z-buffer，800 μL ONPG（4 g/L），待反应液变黄后，加入1 mol/L碳酸钠溶液终止反应并记录反应时间。将反应液离心，吸取上清测定A420nm下的吸光值，利用公式Mnit=（1 000×A420nm）/（T×A600nm）计算酶活。

1.11 凝胶迁移实验（EMSA）

参照文献[25]报道的EMSA实验方法，证明转录因子PsrB是否直接与pig操纵子启动子区域结合[25]。EMSA实验的流程为：1）以黏质沙雷氏菌JNB5-1基因组DNA为模板，表2中所列的引物对PsrB-F2/PsrB-R2为引物，扩增得到psrB基因，并将PCR产物克隆至携带有His标签的pET28a（+）表达载体中得到重组菌株 BL21/pET28a（+）-PrsB，该菌株经过IPTG诱导psrB基因表达后，纯化得到PsrB蛋白；2）以黏质沙雷氏菌JNB5-1基因组DNA为模板，表2中所列的引物对PigA-F/PigA-R为引物，扩增得到携带有pig操纵子启动子区域的DNA片段；3）将纯化的携带有pig操纵子启动子区域的DNA片段与PsrB蛋白的系列稀释液在添加有2×结合缓冲液（40 mmol/L Tris HCl、4 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、10%甘油、2 mmol/L DTT、0.2 mg/mL BSA 和 1 mmol/L EDTA）的EP管中一起室温静置30 min；4）在5 g/dL的非变性PAGE凝胶上进行电泳，用溴化乙啶染色，以显示PsrB蛋白是否能与携带有pig操纵子启动子区域的DNA片段结合。

1.12 黏质沙雷氏菌 JNB5-1、SK8-61、ΔPsrB及JNB5-1/pXW1906发酵产灵菌红素能力分析 参照文献[27]的方法[27]，对黏质沙雷氏菌 JNB5-1、SK8-61、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB/pXW1906 及 JNB5-1/pXW1906于LB培养基或发酵培养基中发酵产灵菌红素能力进行分析。上述菌株对数生长期初期（OD600=0.8）细胞以4%的接种体积分数转接至LB培养基或发酵培养基中，间隔相应时间点取样，溶于酸性乙醇（pH 3.0）中，然后室温静置8 h，离心取上清液，测定波长A535下样品的吸光值，最后根据公式Y=1.193 6X-0.001计算不同时间点各菌株产灵菌红素量（Y表示发酵液溶于酸性乙醇（pH 3.0）时，于波长A535下测定得到的吸光值；X表示菌株产灵菌红素的量）。

2 结果与分析

2.1 PsrB对黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响

为筛选得到黏质沙雷氏菌合成灵菌红素相关基因，按照图2（a）所示的方法，以大肠杆菌E.coli/pRK2013 Tn5G为供体菌，黏质沙雷氏菌S.marcescens JNB5-1为受体菌，构建Tn5G转座子插入突变文库，筛选得到了黏质沙雷氏菌合成灵菌红素能力显著下降突变株SK8-61。反向PCR鉴定突变株SK8-61被阻断基因发现，突变株SK8-61被阻断基因为BVG90_04085，转座子Tn5G插入位点位于基因BVG90_04085编码区第94 bp和第95 bp之间，见图2（b）。进一步通过生物信息学分析发现，基因BVG90_04085编码的转录调控因子BVG90_04085在其N端具有一个螺旋转角螺旋（HTH）的DNA结合域，C端具有一个DeoRC的结构域。

图2 黏质沙雷氏菌合成灵菌红素相关基因psrB的发现Fig.2 Identification of prodigiosin biosynthesis related gene psrB in S.marcescens

摇瓶发酵分析突变株SK8-61及野生型菌株JNB5-1于LB培养基中合成灵菌红素能力发现，较野生型菌株JNB5-1相比，突变株SK8-61合成灵菌红素能力显著降低，发酵24 h后，野生型菌株JNB5-1可合成51.22 mg/L的灵菌红素，而突变株SK8-61仅合成11.21 mg/L的灵菌红素，为野生型菌株的0.22倍，见图3。在功能互补实验中，将基因BVG90_04085整合至载体pUCP18中，得到重组质粒pXW1906，并转移至突变株SK8-61中得到重组菌株SK8-61/pXW1906。摇瓶发酵分析重组菌株SK8-61/pXW1906合成灵菌红素能力发现，重组菌株SK8-61/pXW1906发酵24 h，灵菌红素产量可达50.20 mg/L，显著高于突变株 SK8-61（11.21 mg/L），接近于野生型菌株JNB5-1（51.22 mg/L），表明转录因子编码基因BVG90_04085参与黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。鉴于转录因子BVG90_04085编码基因BVG90_04085具有影响黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的能力，将该基因命名为psrB（Prodigiosin synthesis related gene B）。为进一步验证基因psrB的功能，构建了psrB缺失突变株ΔPsrB和psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906。摇瓶发酵分析菌株ΔPsrB和JNB5-1/pXW1906发酵产灵菌红素能力发现，菌株ΔPsrB和JNB5-1/pXW1906发酵24 h，可分别合成13.28 mg/L和108.46 mg/L的灵菌红素。上述结果表明，PsrB为黏质沙雷氏菌合成灵菌红素刺激因子。

图3 摇瓶发酵分析菌株 JNB5-1，SK8-61，SK8-61/pXW1906，ΔPsrB，ΔPsrB/pXW1906和JNB5-1/pXW1906合成灵菌红素能力Fig.3 Shake flask fermentation to determine the ability of JNB5-1，SK8-61，SK8-61/pXW1906，ΔPsrB，ΔPsrB/pXW1906 and JNB5-1/pUCP16 strains to synthesize prodigiosin

2.2 PsrB对黏质沙雷氏菌细胞生长的影响

为分析转录因子PsrB正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的原因，首先分析PsrB是否影响黏质沙雷氏菌的细胞生长速率。如图4所示，测定野生型菌株JNB5-1、psrB突变株SK8-61和ΔPsrB、功能互补菌株SK8-61/pXW1906和ΔPsrB/pXW1906和psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906细胞生长曲线发现，5株菌株生长无明显差异，表明PsrB不影响细胞生物量的合成，因而不影响黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。

图4 菌株JNB5-1、SK8-61、ΔPsrB、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB/pXW1906和JNB5-1/pXW1908的生长曲线Fig.4 Growth curves of JNB5-1，SK8-61，ΔPsrB，SK8-61/pXW1906，ΔPsrB/pXW1906 and JNB5-1/pXW1908 strains

分析菌株JNB5-1、SK8-61、ΔPsrB、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB/pXW1906 和 JNB5-1/pXW1906单个细胞合成灵菌红素能力发现，较野生型菌株JNB5-1相比，psrB突变株SK8-61和ΔPsrB合成灵菌红素能力显著降低，而psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906合成灵菌红素能力显著提高，见图5。表明转录因子PsrB可能通过影响灵菌红素合成关键基因簇的表达水平来影响黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。

图5 菌株 JNB5-1、SK8-61、ΔPsrB、SK8-61/pXW1906、ΔPsrB/pXW1906和JNB5-1/pXW1906单个细胞合成灵菌红素能力Fig.5 Analysis of unit cell to synthesize prodigiosin in JNB5-1，SK8-61，ΔPsrB，SK8-61/pXW1906，ΔPsrB/pXW1906 and JNB5-1/pXW1906 strains

2.3 PsrB对灵菌红素合成基因簇pig基因簇的转录水平的影响

黏质沙雷氏菌中灵菌红素的合成途径由位于同一操纵子上的 pigA、pigB、pigC、pigD、pigE、pigF、pigG、pigH、pigI、pigJ、pigK、pigL、pigM 和 pigN 等 14个基因组成，见图6（a）。为进一步解析PsrB如何促进黏质沙雷氏菌合成灵菌红素，作者通过RT-qPCR分析了野生型菌株JNB5-1及psrB缺失突变株ΔPsrB中灵菌红素合成基因簇pig基因簇的表达水平。如图6（b）所示，相比于野生型菌株JNB5-1，突变株ΔPsrB中，基因pigABCDEFGHIJKLMN的表达水平均显著下降，分别下调5.81～22.93倍，表明PsrB参与调控灵菌红素合成基因簇pig基因簇的表达水平。

图6 PsrB正调控灵菌红素合成基因簇pig基因簇的转录水平Fig.6 The transcription of pig gene cluster positively regulated by PsrB

为进一步确定PsrB参与调控pig基因簇的表达水平，作者以黏质沙雷氏菌JNB5-1基因组DNA为模板，扩增得到了含有pig基因簇启动子区域的DNA片段，并将其置于不含启动子的lacZ基因的前面，构建得到了携带有融合报告基因PpigA-lacZ的重组质粒 pXW1905（pDN19lacΩ-PpigA），并分别导入菌株JNB5-1及ΔPsrB中得到重组菌株JNB5-1/pXW1905和ΔPsrB/pXW1905，最终通过测定菌株JNB5-1及ΔPsrB中β-半乳糖苷酶的酶活，分析了野生型菌株JNB5-1及psrB突变株ΔPsrB中pig基因簇的表达差异。如图6（c）所示，在野生型菌株JNB5-1中，β-半乳糖苷酶的酶活显著高于psrB突变株ΔPsrB，表明PsrB正调控黏质沙雷氏菌pig基因簇的表达水平。综上所述，PsrB正调控灵菌红素合成基因簇pig基因簇的表达水平。

2.4 PsrB与灵菌红素合成基因族pig基因簇间的相互作用

研究转录因子PsrB是否直接作用于pig基因簇以影响pig基因簇的表达水平，并进而影响黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。通过凝胶阻滞实验（EMSA assay）分析了PsrB与pig基因簇启动子间的相互结合能力，发现转录因子PsrB的加入将阻碍DNA片段PpigA的迁移，见图7（a）。表明转录因子PsrB可直接作用于灵菌红素合成基因簇pig，进一步证实PsrB与pig基因簇间的直接相互作用。将携带有psrB基因的重组质粒pXW1906和pUCP18质粒分别导入至大肠杆菌E.coli DH5α中得到了重组菌株DH5α/pXW1906和DH5α/pUCP18，并将重组质粒 pXW1905分别导入至菌株 DH5α/pXW1906和DH5α/pUCP18 得到了重组菌株 DH5α/pUCP18/pXW1905和 DH5α/pXW1906/pXW1905，测定了两株菌中β-半乳糖苷酶的酶活。如图7（b）所示，在携带有SmPsrB的大肠杆菌 DH5α/pXW1906-pXW1905中，β-半乳糖苷酶的酶活明显高于SmPsrB缺失的大肠杆菌DH5α/pUCP18/pXW1905，表明PsrB可直接作用于pig基因簇，并正调控pig基因簇的表达水平。综上所述，转录因子PsrB通过直接作用于pig基因簇启动子区域，正调控灵菌红素合成基因簇的转录水平，最终达到正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的目的。

图7 PsrB直接调控pig基因簇的表达水平Fig.7 Synthesis of prodigiosin genes directly regulated by PsrB

2.5 转录因子PsrB对黏质沙雷氏菌发酵产灵菌红素的影响

为进一步验证转录因子PsrB对黏质沙雷氏菌发酵产灵菌红素的影响，作者分析了野生型菌株JNB5-1、psrB突变株ΔPsrB、功能互补菌株ΔPsrB/pXW1906及psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906发酵产灵菌红素能力。如图8所示，与野生型菌株JNB5-1相比，psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906发酵72 h后可合成8.61 g/L的灵菌红素，为出发菌株JNB5-1（5.53 g/L）的1.56倍。而psrB缺失突变株ΔPsrB发酵72 h仅可合成1.46 g/L的灵菌红素，为出发菌株的0.26倍。这些结果再次证实转录调控因子PsrB正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素，为代谢工程改造黏质沙雷氏菌合成灵菌红素提供了一种新的策略。

图8 发酵培养基中菌株JNB5-1、ΔPsrB、ΔPsrB/pXW1906和JNB5-1/pXW1906发酵产灵菌红素分析及生长曲线的测定Fig.8 Analysis of prodigiosin production and growth curves of JNB5-1，ΔPsrB，ΔPsrB/pXW1906 and JNB5-1/pXW1906 strains in fermentation medium

3 结 语

灵菌红素是一种由黏质沙雷氏菌产生的天然红色线状三吡咯色素，具有免疫抑制、抗细菌和抗肿瘤等生物活性[12]。研究表明，黏质沙雷氏菌灵菌红素的生物合成受到多种转录调控因子的调控，包括正调控因子 EepR[16]、PigP[17]、GumB[28]和 RbsR[18]，以及负调控因子 MetR[13]、CopA[29]、CRP[30]、HexS[31]、RssB[32]、SmaR[15]和 SpnR[14]。 其中，转录调控因子HexS、EepR、PigP和RssB直接与灵菌红素合成基因簇pig基因簇的启动子区域结合，调节黏质沙雷氏菌合成灵菌红素[16-17，31-32]。CRP通过与转录因子EepR的启动子区域结合，间接调节黏质沙雷氏菌合成灵菌红素[33]。转录因子MetR通过与灵菌红素合成正调控因子PigP的启动子区域结合，负调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素[13]。尽管这些转录因子已被报道参与调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素，但是我们对黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的调控网络的理解依然有限。通过构建一个随机的转座子插入突变体文库，发现DeoR家族转录因子PsrB是一个灵菌红素合成正调控因子。与野生型菌株JNB5-1相比，psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906在LB培养基中的产量是野生型菌株的2.12倍。分析灵菌红素合成基因族pig基因族上pigABCDEFGHIJKLMN的表达水平发现，psrB缺失突变株 ΔPsrB中基因pigABCDEFGHIJKLMN的表达水平显著下调。EMSA分析转录因子PsrB与pig基因簇启动子区域间的相互作用发现，PsrB可直接与pig基因簇的启

动子区域结合。因此，转录因子PsrB正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制是PsrB直接与pig基因簇的启动子区域结合，刺激pig基因簇的转录水平，进而提高黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。从黏质沙雷氏菌合成灵菌红素发酵培养基[27]中发酵菌株JNB5-1/pXW1906产灵菌红素中发现，菌株JNB5-1/pXW1906发酵72 h，可合成8.61 g/L的灵菌红素，为出发菌株JNB5-1（5.53 g/L）的1.56倍。该实验结果进一步证明，转录因子PsrB正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。同时，本研究也为代谢改造黏质沙雷氏菌合成灵菌红素提供了一种新的思路。