猫细小病毒VP2 基因克隆与生物信息学分析

姜 伟，郭明佳，吴树康

（龙口市动物疫病预防控制中心，山东省龙口市 265701）

猫细小病毒（feline parvovirus，FPV）又被称为猫泛白细胞减少症病毒（feline panleukopenia virus），是一种可以感染猫科、浣熊科及鼬科等多种动物的急性、致死性烈性传染病病原[1]。该病原主要通过带毒的粪便、尿液及口腔分泌物传播，可以导致感染动物出现体温升高、呕吐、腹泻及白细胞数量严重减少等多种临床症状，且小型猫科动物对其易感性最高[2]。

FPV 属于细小病毒科（Paroviridae）细小病毒属（Parvovrius），是无囊膜的单股正链DNA 病毒，其基因组主要有两个开放阅读框（open reading frame，ORF）组成，其中右侧ORF 编码重要的病毒结构蛋白——VP1 和VP2[3]。FPV 衣壳主要由VP2 结构蛋白组成，其含量可高达90%。同时，VP2 结构蛋白也是FPV 的主要抗原蛋白及受体结合蛋白，可以有效刺激机体产生针对FPV 的中和抗体并影响其致病性、宿主范围及血凝活性等多种生物学特性[4-5]。

因此，本研究通过对龙口市动物疫病预防控制中心分离保存的FPV 毒株（SD-01）VP2基因进行克隆及生物信息学分析，了解VP2 蛋白的分子特点及变异规律，以期为后续疫苗及诊断试剂盒研发提供参考及理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

全基因组DNA 提取试剂盒（D1800）、质粒小量提取试剂盒（D1100），购自于北京索莱宝科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker（3427A）、DH5α 感受态细胞（9057）、pMD18-T（6011），购自于宝生物工程（大连）有限公司；EasyTaqDNA Polymerase（AP111）酶，购自于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 毒株

FPV 毒株（SD-01）由龙口市动物疫病预防控制中心从2021 年5 月山东省龙口市采集病料中分离鉴定及保存。

1.3 主要方法

1.3.1 引物设计与合成 参照GeneBank 中公布的FPV 全基因组序列（登录号MT614366），使用Primer 5.0 软件设计1 对引物用于扩增SD-01 毒株的VP2基因及其两端非编码区（上游引物序列：5'-aagtaaaaagagacaatcttgcacca-3'；下游引物序列：5'-catacttactatgtttttatg-3'），预期扩增目的片段大小约为1 755 bp。引物序列送至上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2VP2基因克隆及序列分析 参考说明书使用全基因组DNA 提取试剂盒提取SD-01 毒株的全基因组DNA，然后以此为模板使用1.3.1 中设计的引物进行PCR 扩增。PCR 反应体系：EasyTaqDNA Polymerase 25.0 μL，上、下游引物各2.5 μL，DNA 模板2.0 μL，DEPC 水补足50.0 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。使用1.0%的琼脂糖凝胶对PCR 产物进行电泳检测，并使用胶回收试剂盒回收PCR 阳性产物，将回收产物于-20 ℃保存备用。将回收的扩增片段与pMD18-T 载体连接。连接体系：5.0 μL Solution、4.5 μL 胶回收产物、0.5 μL pMD18-T 载体，16 ℃连接30 min。将连接产物转化至DH5α 感受态细胞后涂布于含有氨苄青霉素的LB 固体培养基，37 ℃恒温培养16 h，挑取单个菌落培养并进行菌液鉴定。将菌液鉴定阳性的样品送至上海生工生物工程有限公司进行测序，并参考NCBI 上公布的FPVVP2基因序列，以犬细小病毒（CPV）毒株作为对照，使用DNAstar 及Mega 5.0[6]软件进行同源性分析并构建发育进化树。参考序列详情见表1。

表1 NCBI 上公布的参考毒株VP2 基因序列信息

1.3.3VP2基因生物信息学分析 使用多种软件对FPVVP2基因进行生物信息学分析，具体软件见表2。

表2 本研究所使用的生物信息学工具

2 结果与分析

2.1 VP2 基因扩增与克隆

以1.3.2 中提取的SD-01 株DNA 为模板，1.3.1 中设计的序列为引物，成功扩增出片段大小为1 755 bp 的PCR 产物，与预期结果一致。将PCR 产物回收后连接至pMD18-T 载体上，进行菌液鉴定后送至生物公司进行测序，并将测序结果进行BLAST 比对。比对结果显示，扩增出的PCR产物为FPVVP2基因，并成功构建了重组质粒，将其命名为pMD18-T-FPV SD-01-VP2。

2.2 VP2 蛋白氨基酸同源性比对及系统进化树分析

从GeneBank 中下载已公布的国内FPV 毒株序列及部分国外代表株序列（表1），使用DNAstar 和Mega 5.0 软件，对SD-01 株及其他FPV 毒株的VP2 蛋白进行氨基酸同源性分析并构建系统进化树。氨基酸同源性比对结果显示，SD-01 株VP2 蛋白与其他FPV 株VP2 蛋白相比，氨基酸同源性为99.0%～100%，与CPV 参考序列VP2 蛋白的氨基酸同源性为97.9%～98.1%（图2）。氨基酸序列进化树结果显示，SD-01 株VP2基因与其他FPV 毒株的VP2基因处于同一个大分支，且与葡萄牙分离株PT09 的亲缘关系最为相近（图3）。

图1 FPV SD-01 株VP2 基因PCR 扩增结果

图2 SD-01 株VP2 基因氨基酸同源性分析结果

图3 SD-01 株VP2 基因氨基酸序列系统进化树

2.3 VP2 蛋白基本理化性质

使用在线软件Prot-Param 对SD-01 株VP2蛋白的基本理化性质进行预测[5]。结果显示：VP2 蛋白共由584 个氨基酸组成，其分子式为C2884H4357N785O882S17，共含有8 925 个原子，理论相对分子质量为64 683.07 u；含有56 个负电荷氨基酸残基，44 个正电荷氨基酸残基，理论等电点为5.44；理论的不稳定系数为27.80，属于稳定蛋白。蛋白的亲疏水性预测结果为-0.508，表明VP2 蛋白可能为亲水性蛋白。

2.4 VP2 蛋白结构分析

使用在线软件SignalP-5.0 和TMHMM Server v.2.0，预测SD-01 株VP2 蛋白信号肽和跨膜区域，发现信号肽预测值为0.002（图4），表明VP2 蛋白无信号肽区域，推测其可能为非分泌型蛋白。跨膜区预测结果（图5）显示，VP2 蛋白可能为非跨膜蛋白，且主要定位于膜外区域。

图4 SD-01 株VP2 蛋白信号肽预测结果

图5 SD-01 株VP2 蛋白跨膜区预测结果

应用SOPMA 软件和SWISS-Model 数据库，对SD-01 株VP2 蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果（图6）显示，VP2 蛋白二级结构中含有51 个α 螺旋（蓝色）、143 个延伸链（红色）、25 个β 转角（绿色）和365 个无特定结构的卷曲（橘色），分别占二级结构的8.7%、24.5%、4.3%和62.5%。SWISS-Model 同源建模结果（图7）显示，VP2 蛋白三级结构中，以无规则卷曲为主，该结果与二级结构预测结果相一致。

图6 SD-01 株VP2 蛋白二级结构预测结果

图7 SD-01 株VP2 蛋白三级结构预测结果

2.5 VP2 蛋白亚细胞定位预测

使用在线软件TargetP 1.1 和PSORT II Prediction，对FPV SD-01 株VP2 蛋白的亚细胞定位进行预测。结果显示：VP2 蛋白不含有线粒体导肽（mTP）或分泌通道信号肽（SP）；VP2 蛋白定位在细胞质和细胞核中的概率较高，分别为47.8%和26.1%；定位在线粒体、细胞质膜和细胞骨架的可能较低，分别为17.4%、4.3%和4.3%。同时，VP2 蛋白的C 端含有一个过氧化物酶靶向信号，可能会被过氧化物酶识别从而发挥其生物学功能。

2.6 VP2 蛋白B 细胞抗原表位分析

采用在线软件Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0，对VP2 蛋白的B 细胞抗原表位进行预测，并结合蛋白的二级结构、表面可及性及抗原指数性等因素，预测VP2 蛋白可能存11 个氨基酸数目大于7 的抗原表位，分别为4～56、86～99、156～167、213～239、270～279、294～315、322～328、337～445、507～520、551～562 和574～580，抗原趋势最高值为0.681，是位于第18位氨基酸残基精氨酸上（表3、图8）。

表3 SD-01 株VP2 蛋白B 细胞抗原表位预测结果

图8 SD-01 株VP2 蛋白的B 细胞抗原表位预测结果

2.7 VP2 蛋白翻译后修饰位点预测

本研究采用多种蛋白翻译后修饰预测软件（NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0），对FPV VP2 蛋白进行修饰位点预测。结果显示：VP2 蛋白可能存在49 个磷酸化修饰位点，其中丝氨酸（S）12个、酪氨酸（T）9个、苏氨酸28个（图9）；6 个N-糖基化修饰位点，分别为第25、47、64、180、443、505 位（图10）；21 个O-糖基化修饰位点，分别为第2、21、23、27、41、221、223、225、226、228、230、348、349、355、388、389、390、391、394、399、433 位。这些修饰位点在FPV VP2 蛋白内高度保守，因此推测这些位点可能影响了VP2 蛋白的构象或生物学功能。

图9 SD-01 株VP2 蛋白的磷酸化修饰位点预测结果

图10 SD-01 株VP2 蛋白的N-糖基化修饰位点预测结果

3 讨论

无囊膜病毒主要由衣壳蛋白及遗传物质组成。其中衣壳蛋白在无囊膜病毒感染细胞及其复制过程中发挥着关键作用，影响着病毒的宿主嗜性、细胞敏感性、致病性以及对宿主天然免疫的拮抗能力。同时，衣壳蛋白也是无囊膜病毒的重要抗原蛋白，具有良好的免疫原性，可以诱导机体产生高水平的细胞免疫和体液免疫。FPV 衣壳蛋白主要由结构蛋白VP1 和VP2 组成。VP1 虽占衣壳蛋白的总量不高，不足15%，但其是产生具有感染性病毒粒子的必要组分[7]。VP2 蛋白是衣壳蛋白的主要成分，其含量占衣壳蛋白的80%以上，同时也是FPV 主要的抗原蛋白，可以诱导机体产生有效的中和抗体[8]。同时，VP2 蛋白也是面对宿主压力重要的变异蛋白，因此对细小病毒的遗传进化分析主要是针对VP2 蛋白。

本研究克隆了FPV SD-01 株的VP2基因，测序得知VP2基因全长为1755 bp，共编码584 个氨基酸。根据VP2 蛋白氨基酸序列构建的系统进化树可知，分离毒株SD-01 虽为国内分离株，但在亲缘关系上与葡萄牙分离株PT09 更为接近，而PT09 株分离时间较早，因此推测SD-01 株可能是从国外传播到国内的。目前CPV 虽有多种亚型的报道，且新亚型有取代传统亚型成为主要流行毒株的趋势，但是关于FPV 亚型的分类还未见到相关报道[9-11]。本研究构建的FPV VP2 蛋白氨基酸序列系统进化树显示，所有FPV 毒株位于一个大分支上，但除了少数毒株外，大部分FPV 毒株又可被分为3 个小分支。由此推测在宿主和免疫的双重压力下，FPV有进一步进化从而产生亚型分化的趋势，所以临床上要加强对FPV 的流行病学监测，以便在新变异亚型出现时可以快速应对。

通过对SD-01 株VP2 蛋白的理化性质及高级结构预测分析可知，VP2 蛋白为亲水性非分泌性蛋白，没有跨膜区，因此推测大肠杆菌、酵母、昆虫细胞-杆状病毒、真核细胞等多种表达系统都可被用于高效表达VP2 蛋白。VP2 蛋白上有两个主要的抗原决定簇A 和B，其中决定簇A 由第93、222、224、426 位氨基酸残基组成，B 由第299、300、302 位氨基酸残基组成[12]。通过对SD-01 株VP2 蛋白的B 细胞抗原表位进行预测可知，这两个抗原决定簇都位于SD-01 株VP2 蛋白的B 细胞优势表位内，且SD-01 株VP2 蛋白的两个抗原决定簇与疫苗株一致，因此推测疫苗株可以给动物提供针对SD-01 株的有效保护。

FPV、CPV、猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）及小鼠细小病毒（mouse parvovirus，MPV）等均属于细小病毒科、细小病毒属。根据遗传进化分析可知，FPV 与CPV 亲缘关系最为接近，与PPV 亲缘关系次之，而与其他细小病毒亲缘关系较远。通过比较FPV 及其他细小病毒VP2 的生物信息学差异发现，不同动物源细小病毒的VP2 蛋白氨基酸序列存在差异，但生理生化性质较为相似，均为亲水性无跨膜区的稳定蛋白。蛋白质高级结构比较发现，不同种细小病毒VP2 蛋白均主要由无规则卷曲组成，α 螺旋及β 折叠所占比重较小，且三级结构高度一致。除氨基酸序列本身，蛋白翻译后修饰同样对抗原的免疫原性有着重要作用，通过比对不同细小病毒 VP2 蛋白的重要抗原表位及潜在翻译后修饰位点，可见不同细小病毒的VP2 蛋白存在部分一致的蛋白翻译后修饰位点，但抗原表位仍具有明显差异。比较不同细小病毒VP2 蛋白的生物信息学差异，有利于更好地研究VP2 蛋白在不同细小病毒进化过程中所发挥的作用，为广谱的抗细小病毒药物及分子制剂筛选及研发奠定基础。