叉头框蛋白O与恶性肿瘤的研究进展△

翁小坤，孙菲，于静萍

南京医科大学附属常州第二人民医院放疗科，江苏 常州 213003

近年来，恶性肿瘤的发病率逐年上升，临床现有的治疗手段，如手术、放疗、化疗及免疫治疗等均无法达到理想的治疗效果。叉头框蛋白O（forkhead box O，FOXO）可在多个方面对放疗、化疗、免疫治疗等发挥增敏作用，对其进行深入研究，可为临床恶性肿瘤的治疗提供新思路，本文就近年来FOXO的研究进展进行综述。

1 FOXO概述

叉头框蛋白（forkhead box，FOX）家族属于进化较为保守的蛋白质转录因子家族，由3个α-螺旋和2个环或“翼”结构域组成。FOXO蛋白家族是一种普遍表达的转录因子，在高等生物中发挥重要作用。FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6主要在哺乳动物中发挥作用，但其在组织中表达情况并不相同，FOXO1、FOXO3a和FOXO4在心、脑、肾、肌肉、脂肪等组织中广泛表达，但FOXO6目前仅表达于中枢神经系统。上述转录因子均有一个叉状的DNA结合区域，受磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号转导通路调控，参与细胞的周期阻滞、DNA损伤修复及凋亡等过程。此外，有研究表明，FOXO基因家族通过调节转录因子的特异性激活来调控机体生长发育、能量代谢及肿瘤的发生发展过程。

2 FOXO的作用机制

FOXO是PI3K/AKT信号通路的下游靶点，并通过生长因子/PI3K/AKT通路对FOXO进行负调控。生长因子与受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）结合可使RTK通过自身磷酸化而活化。活化的RTK可通过RTK或衔接蛋白细胞尾部的磷酸酪氨酸位点募集PI3K并使其激活，从而进一步活化磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3）。活化的PIP3可导致AKT活化，而活化AKT又可导致FOXO的磷酸化。14-3-3蛋白可以与磷酸化的FOXO结合，并将其从细胞核转运至细胞质，从而抑制其转录功能。相反，c-Jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）及蛋白激酶（mammalian Ste20-like kinase，MST）活化可导致FOXO3a或14-3-3蛋白的磷酸化，使FOXO3a与14-3-3蛋白在细胞质中解离，从而导致FOXO3a重新向细胞核移位。此外，AMP依赖的蛋白激酶[Adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]可介导FOXO的磷酸化，并增强其转录活性，但却不改变 FOXO的细胞定位。IκB激酶（IκB-kinase，IKK）可不依赖AKT而直接与FOXO3a相互作用使其磷酸化，并导致FOXO3a的降解。激活的FOXO通过下游的细胞死亡调解因子（Bim）、脂肪酸合成酶配体（fatty acid synthase-ligand，FAS-L）、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）等调控细胞的凋亡过程。FOXO3a激活后可移位至细胞核靶基因，激活FAS-L以诱导细胞凋亡。此外，FOXO3a激活后可与Bim启动子结合上调Bim的表达，与B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）家族结合进一步激活胱天蛋白酶（caspase）和凋亡效应蛋白[Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）、Bak]，以引起细胞凋亡。FOXO还可通过TRAIL，激活TRAIL受体1（TRAIL receptor 1，TRAILR1，又称DR4）和TRAILR2（又称DR5）以促进细胞凋亡。此外，TRAIL与DR4、DR5结合并募集死亡结构域衔接分子（fas-associated protein with death domain，FADD）与caspase 8形成信号转导复合物，导致caspase 8的自催化活化，经caspase 3触发caspase级联反应以诱导凋亡性细胞凋亡。

生理状态下，通过上述通路，可使FOXO在磷酸化与去磷酸化间维持平衡，在细胞核与细胞质间穿梭维持正常水平，在促进细胞凋亡与促进细胞增殖间保持平衡。但在病理状态下，FOXO上的AKT、ERK、IKK等激酶异常激活，导致FOXO的大量磷酸化，使大量FOXO从细胞核排出，并通过泛素/蛋白酶体途径降解，而这种磷酸化失调引起的FOXO降解可导致细胞的代谢水平失调。

3 FOXO与恶性肿瘤的关系

3.1 抑制肿瘤的发生发展

细胞在氧化应激和缺氧等应激条件下常可发生癌变，最终形成肿瘤，哺乳动物FOXO基因表达的蛋白是一种多效转录因子，参与调节对细胞存活至关重要的广泛通路。研究表明，敲除FOXO3a会增加胸腺淋巴瘤及血管瘤的发生率，这多与FOXO3a的异常转录后修饰相关，而这多与上游PI3K/AKT等激酶异常激活导致FOXO的磷酸化失调有关。大量上游激酶过度激活后，引起大量FOXO的磷酸化，使其从细胞核排出至细胞质中被降解，抑制细胞凋亡等途径，从而促进细胞的增殖和癌变。

FOXO也被证明抑制肿瘤细胞转移的作用，这可能是因为其上游通路激活减少，导致FOXO磷酸化水平减少，细胞核中发挥功能的FOXO含量增加。FOXO表达与前列腺癌的转移呈反比，敲低FOXO4可促进前列腺癌的淋巴结转移，这种转移与PIP、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制性蛋白1（calmodulin dependent protein kinase Ⅱ inhibitor 1，CAMK2N1）、脂肪特异性磷脂酶A2（adipose-specific phospholipase A2，PLA2G16）和胃泌素（progastricsin，PGC）等基因相关，敲低上述基因可以减少FOXO4低表达引起的淋巴结转移。FOXO1及FOXO4的表达可以通过负调控RUNX2的转录活性而抑制前列腺癌细胞迁移和侵袭。FOXO1还可以直接与RUNX2结合，抑制与RUNX2结合的转移基因如白细胞介素-8（interleukin 8，IL-8）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基质金属肽酶13（matrix metallopeptidase 13，MMP13）的启动子，来减少肿瘤细胞转移。FOXO4还可增强膜联蛋白A8（annexin 8，ANXA8）的表达，从而抑制胆管癌中生长因子介导的肿瘤转移。此外，FOXO1也可以通过抑制上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程达到抑制肿瘤转移的目的。持续的肿瘤血管生成是肿瘤侵袭获取营养的关键，而FOXO1和FOXO3可通过限制内皮细胞迁移和管腔形成导致血管生成受阻，进一步抑制肿瘤转移。由此可见，FOXO基因的表达可以有效抑制肿瘤细胞的侵袭和转移过程。

3.2 促进肿瘤的发生

越来越多研究表明，FOXO可促进肿瘤的发生和发展，但其具体机制尚未完全明确，可能与其上游激酶的异常调节相关。研究发现，FOXO6在乳腺癌、膀胱癌、胃癌及脑肿瘤组织中表达上调。FOXO还对慢性和急性髓性白血病中的肿瘤细胞生长和维持有支持作用，其主要通过与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号转导通路的相互作用介导。FOXO因子和TGF-β/BMP可以在转录水平上调节真核细胞生长正调节因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，MTORC1）水平，从而导致干细胞过度增殖，最终促进肿瘤的生长。

3.3 抗肿瘤治疗

FOXO转录因子在上游PI3K、AKT等的激酶调控下参与了肿瘤发生发展的多个过程，因此，对FOXO深入研究有助于抗肿瘤治疗。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）在维持自身免疫耐受和预防自身免疫疾病方面有重要意义。Treg细胞在恶性肿瘤患者中表达上调，且可能会被募集到肿瘤组织中以促进细胞免疫耐受，从而促进肿瘤的生长。但对于AKT不敏感的FOXO1突变体来说，FOXO转录因子可阻断Treg细胞归巢至非淋巴器官，从而抑制肿瘤的生长。由此可见，研究FOXO1突变与Treg细胞的关系可能可通过免疫途径进行肿瘤治疗。

FOXO转录因子可通过Bim介导伊马替尼对BCR/ABL基因融合突变白血病细胞凋亡的促进作用；其他抗肿瘤药物，如曲妥珠单抗，也可激活FOXO介导肿瘤细胞凋亡。上述抗肿瘤药物主要作为PI3K/AKT通路抑制剂来促进FOXO的激活，但其在利用FOXO进行治疗肿瘤时也会引起耐药，主要耐药机制包括以下两个方面：①FOXO1可上调肿瘤细胞中多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein 1，MDR1）的表达。②FOXO激活与PI3K的反馈回环，促进耐药。研究发现，在PI3K/AKT通路过度激活的肿瘤细胞中，PI3K/AKT抑制剂在促进FOXO活化、抑制肿瘤生长的同时，FOXO蛋白的过表达可反馈性引起AKT的活化和磷酸化，从而导致FOXO失活，形成耐药。此外，一些抗肿瘤药物可通过促进肿瘤细胞的氧化应激反应而发挥细胞毒性作用，而FOXO可诱导抗氧化酶的表达保护使肿瘤细胞免受其细胞毒性作用来减弱药物的抗肿瘤作用。

因放疗可精确照射肿瘤病灶发挥重要的抗肿瘤作用，FOXO对于放疗的敏感性极为重要，而DNA损伤修复是放疗疗效的决定性因素。电离辐射在照射肿瘤组织时，射线作用于细胞间水分子及其他分子，导致其电离产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和其他有害物质。ROS和有害物质可与脂质、DNA及蛋白质结合并对其造成损害，从而促进肿瘤细胞凋亡以达到抗肿瘤治疗的目的。电离辐射还可直接照射在肿瘤细胞的DNA上，导致DNA单链或双链断裂引起肿瘤细胞凋亡来达到抗治疗肿瘤的目的。DNA损伤后可通过阻滞细胞周期、影响细胞的自噬过程、改善组织细胞的乏氧状态等，修复DNA引起的放疗抵抗。DNA损伤时可激活共济失调毛细血管扩张RAD3相关蛋白（ataxia telangiectasia and Rad 3-related protein，ATR），进一步激活细胞周期检查点（checkpoint 1，CHK1），将细胞周期阻滞于S期及G/M期，进而促进DNA损伤修复。DNA双链损伤时可以激活毛细血管扩张性共济失调突变基因（ataxia telangiectasiamutated gene，ATM）进一步上调P21的表达，并诱导细胞周期G期停滞；CHK2和乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene l，BRCA1）可诱导细胞周期S期和G/M期停滞，为DNA损伤修复提供时间。ATM还可以通过非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）及同源重组（homologous recombination，HR）参与DNA的损伤修复过程。此外，DNA损伤时，DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-dependent protein kinase,catalytic subunit，DNA-PKcs）与 Ku70/80 异二聚体形成结合DNA-PK全酶，然后通过与NHEJ介导断裂的DNA末端直接相连，达到修复DNA的目的。多项研究发现，FOXO3丢失可导致原始造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）中DNA损伤的累积，特别是与修复氧化性DNA损伤的基因表达下调有关。FOXO3a过表达与哺乳动物的生存期延长有关，且这可能与FOXO3a参与DNA的损伤修复过程有关。DNA受射线照射损伤时，可以触发FOXO3a在细胞周期中的两个关键检查点（G/S和G/M），有效将细胞周期阻滞于G、G期，从而延长细胞周期由G期向S期及G期向M期进展的时间。此外，FOXO因子还可以与DNA结合以诱导DNA的损伤修复，这可能与涉及的基因启动子的位点有关。FOXO3a还可与ATM结合，并通过ATM的磷酸化来激活，从而进一步导致DNA的损伤修复过程。FOXO3a缺失的造血干细胞似乎更容易发生受损DNA的累积与染色体异常。这主要是因为FOXO3a缺失可导致碱基切除修复（base-excision repair，BER）相关的多种关键基因，如 DNA 聚合酶β（DNA polymerase β，POLB）、X 线修复交叉互补蛋白1（X-ray repair cross complementing 1，XRCC1）、DNA连接酶1（DNA ligase 1，LIG1）及核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）的表达明显下调，导致细胞DNA损伤修复功能受损，从而引起受损DNA的累积。由此可见，上游通路通过抑制FOXO的激活来减少DNA的损伤修复，以降低放疗抵抗，从而增加放疗疗效。

FOXO1因子转录活性的增强不仅可上调自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）的表达，还可通过雌三醇（sestrin3，SESN3）基因的转录抑制雷帕霉素（mechanistic target of rapamycin，MTOR）机制性靶标，诱导自噬的增强。研究显示，通过抑制肿瘤细胞自噬可发挥良好的抗肿瘤治疗效果，这是因为化疗期间自噬可能作为保护机制诱发耐药，最终导致多药耐药。自噬还可以通过清除X线照射产生的有毒物质（如自由基、受损的蛋白质或细胞器），从而达到保护细胞的作用，引起肿瘤细胞的放疗抵抗。通过使用自噬抑制剂和自噬相关基因（如BECN1、ATG）的遗传沉默或敲低，具有增加肿瘤细胞放射敏感性的潜力。考虑到FOXO可以促进肿瘤细胞的自噬，或许可通过靶向FOXO调控肿瘤细胞的自噬过程，为抗肿瘤治疗提供新方案。

4 小结与展望

近年来，肿瘤已经是人类死亡的主要原因，而多种肿瘤的发生发展过程与人体内信号转导失衡有关。尽管目前对信号转导的研究有了较大的进展，并研制出了相应药物，但仍存在多种难以理解的耐药机制。因此，明确细胞信号转导机制，据此研制新型抗肿瘤药物显得格外重要，而PI3K、AKT、IKK等上游激酶代谢失调引起体内FOXO代谢失衡是导致肿瘤发生发展的主要原因之一。因此，研究FOXO信号通路可以为减少肿瘤发生风险及抗肿瘤治疗提供一种新思路。

FOXO作为一种转录因子，其激活被可通过促进细胞凋亡、抑制增殖而达到抗肿瘤治疗的目的，FOXO也可通过Treg的作用来增强免疫治疗疗效。且FOXO可以增强自噬而发挥放化疗增敏作用，但抑制FOXO的活化又可减少DNA损伤修复而增强放疗疗效。此外，FOXO可促进肿瘤细胞发生转移，表明其在肿瘤的发生发展过程中的作用较为复杂，但造成这种作用的原因尚不明确。FOXO可影响人体正常的代谢过程，其持续性激活会导致人体正常生理功能紊乱，导致人体无法耐受。

本文简略讨论了FOXO基因对肿瘤发生发展的影响，其失衡与肿瘤的发生发展密切相关，而干扰其上游通路可影响FOXO的活化状态，因此，对这些通路的研究可能有助于开发抗肿瘤治疗新型药物。