基于网络药理学对附子汤的主要活性成分、临床定位及作用机制分析

王雅芝，段灿灿，2，何天目，张建永，2

(1. 遵义医科大学 药学院药剂学教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；3.遵义医科大学 基础医学院，贵州 遵义 563099)

附子汤，首见于东汉医学家张仲景的《伤寒论》，由附子、茯苓、人参、白术与芍药组成，具有温阳祛寒，宁心安神，健脾利水之功，主治阳虚寒湿内侵之证[1]。其中附子[2-3]辛甘大热，具有回阳救逆、温肾助阳，散寒止痛的功效，为君药；白术[4]、茯苓[5-6]利水渗湿、健脾益气且白术可增强附子去寒湿之邪的功效，为臣药；气属阳，阳虚必兼气虚，故用人参[7]补益元气，不仅可加强附子的回阳救逆之功，而且有助于复脉固脱、祛除邪气，为佐药；更佐芍药[8-9]养血柔肝、敛阴收汗、和营止痛，以监附子之悍等症状。古代运用此方一般多用来治疗少阴阳虚、寒湿停聚肢体关节的疼痛[10]。现代多将其用于治疗心血管系统疾病、类风湿性关节炎、妇科病以及妊娠病等[1]，然而其在临床治疗疾病的精准定位还不甚清楚，作用机制也有待进一步研究。

近年来，中药网络药理学在人类疾病研究方面被广泛应用[11-12]。中药方剂由多味中药根据“君臣佐使”的原则进行配伍而得，是由多种化学成分及多个靶点之间协同作用的复杂体系，使得对中药方剂的深入研究出现很大的困难，网络药理学整合了系统生物学、网络生物学、网络分析和传统药理学等多学科的技术和内容，具有整体性、系统性等优点，是阐明中药配方中活性成分和潜在机理的新策略[13-15]。因此，本研究采用网络药理学方法分析附子汤中活性成分相关靶点的作用器官及其药效物质基础，进一步发现附子汤的临床精准定位，为深入开展附子汤的作用机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 活性成分的筛选 本研究采用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以附子、人参、茯苓、白术、白芍为关键词，检索附子汤中5味中药的全部化学成分。以化合物口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18作为活性成分的筛选条件[16-17]。但是，依据上述活性成分筛选方法，仍会将部分具有药理作用的有效成分筛除。因此，本研究根据已有的文献报道进一步验证和补充，最终确定出附子汤中具有活性的成分。

1.2 靶点的预测与构建 通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、ChEMBL数据库(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)、TargetNet数据库(http://targetnet.scbdd.com/calcnet/index/)和UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库进行靶点预测，最后得到活性成分的相关靶点。然后采用Cytoscape 3.7.1软件构建“药味-活性成分-相关靶点”网络，根据网络特征指标度(Degree)和介数(Betweenness)进行分析，筛选出附子汤的关键活性成分。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction，PPI)网络的构建 基于STRING平台(https://string-db.org/)将所获取的相关靶点导入数据库，选择“Homo sapiens”，选择Highest confidence(0.9)，然后采用Cytoscape3.7.1软件构建附子汤作用靶点的蛋白相互作用网络图，根据点度中心性(DC，Degree centrality)、接近中心性(CC，Closeness centrality)和中介中心性(BC，Betweenness centrality)的大小进行筛选，将其设置靶点的颜色，从而筛选出附子汤中发挥重要作用的靶点。

1.4 器官定位及靶点-疾病-器官网络的构建 将所得的附子汤活性成分对应的靶点导入CTD在线分析平台(http://ctdbase.org/)，得到与靶点相关的疾病，将相关疾病根据疾病类型进行分类，采用BioGPS数据库[18](http://biogps.org/)对相关靶点进行器官定位，将所获得的信息导入Cytoscape 3.7.1软件绘制“靶点-疾病-器官”网络，进一步分析附子汤治疗疾病的临床定位，并结合文献报道研究其治疗的主要疾病。

1.5 生物功能注释分析和通路富集分析 利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)分别对PPI网络中的核心靶点和作用于肝脏和心脏的靶点进行生物功能注释分析(GO)和通路富集分析(KEGG)，限定物种为“Homo Sapiens”，最后采用ImageGP在线平台(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php)对富集分析结果进行可视化分析，分析附子汤可能的主治病症，从而为附子汤临床定位提供依据。

1.6 整合网络分析 将上述的“药味-活性成分-相关靶点”、“作用靶点-作用器官”和“作用靶点-关键通路”等信息分别导入Cytoscape 3.7.1软件中，运用Merge功能，将其合并得到“药味-活性成分-靶点-关键通路”的分析网络，从而进一步探讨附子汤的整体药理机制。

1.7 分子对接验证 运用AutoDock Vina软件对“药味-活性成分-相关靶点”网络中度值前5的关键活性成分与PPI网络中筛选出来的核心靶点进行分子对接验证。首先通过RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获取靶点蛋白晶体结构，通过Open Babel软件将5个关键成分的SDF格式转化为PDB格式；再利用AutoDock对接软件对蛋白晶体结构去水加氢、计算电荷、去除原配体，对配体分子通过Torsion Tree进行调整，设置配体分子的可扭转键，并分别进行能量优化，保存为PDBQT文件。通过AutoDock Vina软件计算其对接活性位点、结合能及均方根偏差(RMSD)，结合能越低表示成分与靶点蛋白的对接效果越好。最后运用Discovery Studio 4.5软件对对接结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 活性成分的筛选结果 通过TCMSP数据库，分别对附子汤中的5味中药进行检索，以OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，得到附子中活性成分21个，其中茯苓中活性成分15个，人参中活性成分22个，白术中活性成分7个，白勺中活性成分13个。剔除重复的活性成分，共收集到附子汤中75个化学成分。根据已有的文献报道得知，附子汤中单酯型生物碱具有较强的活性。因此，将苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱3个成分也纳入活性成分[19]，最终确定附子汤中78个活性成分。附子汤中筛选出来的主要活性成分信息，如表1所示。

表1 附子汤中主要活性成分信息表

续表

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2.2 活性成分-靶点网络的分析 运用TargetNet数据库进行靶点预测，共获得131个相关靶点。利用Cytoscape3.7.1软件，将附子汤的5味中药、78个活性成分和131个相关靶点建立可视化网络拓扑图，见图1。“药味-活性成分-相关靶点”网络图由211个节点，537条边构成，平均节点度(degree)为5.1。通过网络图中可以看出附子和人参中的活性成分最多，从而证实了附子是附子汤中的君药，人参作为佐药调和方剂中的阴阳平衡。运用Network analysis插件对网络特征指标分析得知：degree排名前5的活性成分是山柰酚(白芍、人参；degree=40)、灌木远志酮 A(人参；degree=36)、11，14-二十碳二烯酸(附子；degree=33)、花生四烯酸(人参；degree=28)、石竹胺(人参；degree=28)。每味药材中对应的degree最高的活性成分分别是附子(11，14-二十碳二烯酸，degree=33)、茯苓(常春藤皂苷元，degree=6)、人参(山柰酚、degree=40)、白术((3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-dimethyl-17-[(2R，5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，degree=28)、白芍(山柰酚、degree=40)，其中山柰酚是人参和白芍共有的活性成分，11，14-二十碳二烯酸在总排名和单味中药中degree均较高，进一步说明这些成分可能是附子汤中发挥作用的关键成分。

V形代表药味；六边形代表活性成分；四边形代表靶点。图1 药味-活性成分-靶点网络

2.3 靶点蛋白相互作用网络构建与分析 运用STRING数据库将上述获得的131个靶点蛋白进行蛋白互作关系分析，限定物种“Homo sapiens”，选择High confidence(0.9)，保存其TSV格式文件并导入Cytoscape 3.7.1软件进行拓扑分析，获取了83个相互作用的重要靶点，其中23个黄色节点代表第一次拓扑分析中得到的核心靶点。在第一次拓扑分析中，根据DC≥10、CC≥0.20和BC≥0.00为标准，获得了23个节点和163条边，其中5个黄色节点代表在第二次拓扑分析中得到的核心靶点；经第二次拓扑分析，以DC≥18、CC≥0.25、BC≥0.02为标准，最终得到5个节点，10条边，5个核心靶点分别是CXC趋化因子受体4型(CXCR4)、α-2C肾上腺素能受体(ADRA2C)、大麻素受体2(CNR2)、α-2B肾上腺素能受体(ADRA2B)、α-2A肾上腺素能受体(ADRA2A)，见图2。根据分析得知CC或BC靶点越大，其DC值越大，说明这些靶点之间有很强的协同作用。

图2 靶点蛋白PPI网络

2.4 器官定位及靶点相关疾病分析 将筛选出来的相关靶点运用CTD数据库进行分析，以P≤0.01为筛选条件，发现131个靶点与194种疾病有关，将疾病按CTD数据库默认的系统进行分类，共归为22种疾病类型，根据P值和注释基因数量排序，排名靠前的疾病有肿瘤、消化系统疾病、先天性及遗传性、心血管疾病、女性泌尿生殖系统疾病、神经系统疾病等。通过BioGPS数据库对靶点进行器官定位，结果发现这些靶点主要作用于心、肝、肺、肾等，如图3，图中左侧的条形图代表靶点数，可知心和肝的作用靶点个数较多，分别是30和22。进一步采用Cytoscape 3.7.1软件构建“靶点-疾病类别-器官”网络图，拓扑异构分析degree排名前5的疾病类型分别是：癌症、心血管疾病、消化系统疾病、泌尿生殖系统疾病、神经系统疾病(见图4)，其中PTGIR为心和肝的共同靶点(见图5)。PTGIR基因突变会在纤维肌肉发育不良(FMD)患者中产生富集，同时在自发性冠状动脉夹层(SCAD)患者中发现前列环素信号在非动脉粥样硬化性狭窄和夹层中起作用[20]。然后将这5种类型所对应的疾病根据基因数量进行排序，得到每种系统类型发挥疗效最高的疾病，见表2。通过图表得知，这5种类型对应的疾病主要集中在肝脏和心脏，与器官定位结果相吻合，进一步证明这五种类型可能是附子汤发挥药理作用及临床定位的主要方向。

图3 靶点器官定位分布情况

V形代表器官，六边形代表作用靶点，四边形代表疾病类型。图4 作用靶点-疾病类型-器官网络

V型代表器官；六边形代表作用靶点；四边形代表疾病类型；圆形代表心和肝共有的作用靶点。图5 心和肝的作用靶点-疾病类型-器官网络

表2 相关靶点对应的主要疾病信息

2.5 GO生物进程分析和KEGG通路富集分析 富集分析结果显示生物过程(BP)主要涉及G蛋白偶联受体信号通路、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、氧化还原反应、炎症反应等183个Go-terms；分子功能(MF)涉及锌离子结合、序列特异性DNA结合、转录因子活性、类固醇激素受体等83个Go-terms；细胞成分(CC)主要涉及质膜、膜的组成部分、核质等19个Go-terms。分别筛选出基因数量大于10的Go-terms进行绘制柱状图，见图6。KEGG分析共得到21条信号通路，见图7。根据GeneRatio、P值以及调控通路上的基因个数筛选出5条关键通路，包括神经活性配体-受体相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、甾体激素生物合成(Steroid hormone biosynthesis)、花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、5-羟色胺能突触(Serotonergic synapse)、甲状腺激素信号通路(Thyroid hormone signaling pathway)。其中将作用于肝脏和心脏的靶点单独进行KEGG分析共得到11条信号通路，主要包括神经活性配体-受体相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、甲状腺激素信号通路(Thyroid hormone signaling pathway)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)、多巴胺能突触(Dopaminergic synapse)、胰岛素抵抗(Insulin resistance)等通路，见图8。

图6 活性成分相关靶点生物功能分析

图7 活性成分相关靶点通路注释分析

图8 作用于心肝的靶点通路注释分析

2.6 整合网络分析 附子汤的“药味-活性成分-靶点-关键通路”网络由78个活性成分、131个作用靶点及5条关键通路之间的关系，构成了一个具有多成分、多靶点、多通路的整合网络，见图9。从网络图中可以看出附子汤中的活性成分具有多个作用靶点，同时每个作用靶点参与到多条信号通路中，构成了一个具有多成分、多靶点、多通路的整合网络。同时，将作用于肝脏和心脏的靶点进行KEGG分析，得知神经活性配体-受体相互作用通路和甲状腺激素信号通路是附子汤富集靶点最多的通路(见图9A和B)。

图9 药味-活性成分-靶点-关键通路网络

2.7 分子对接验证 根据结合能筛选出对接结果最好的每个关键活性成分与靶点蛋白分别进行可视化分析，见图10，其中山柰酚和石竹胺均能与靶点CNR2形成氢键，11，14-二十碳二烯酸与靶点CNR4形成氢键。因此，根据关键活性成分与关键靶点的结合能力分析得知：附子汤主要作用于中枢神经系统，为其临床定位研究提供了理论依据。关键活性成分与靶点蛋白的分子对接结果，如表3所示。

图10 关键成分与靶点CXCR4、ADRA2C、CNR2、ADRA2B、ADRA2A结合能排序最低的最佳对接构象

表3 关键成分及核心靶点的结合能

3 讨论

附子汤具有温经助阳、祛寒除湿之功。古代临床常用本方加减治疗风湿性关节炎、类风湿关节炎等属阳虚寒盛类疾病，也用于慢性心功能不全、慢性肾炎、肝炎、月经后期等属脾肾阳虚、寒湿内阻类疾病。为了研究附子汤现代临床的精准定位及应用，明确其药理作用的分子机制，本研究通过国内外文献、TCMSP数据库研究了附子汤5味中药的活性成分，构建了“药味-活性成分-靶点”网络图，同时分析了作用靶点之间的互作关系及器官分布和功能通路富集，发现附子汤的作用部位主要分布在肝脏和心脏，作用的疾病类型主要有肝癌等癌症、心血管疾病和消化系统疾病，从而为附子汤的临床定位提供了科学依据。

在附子汤“药味-活性成分-靶点”网络中，化合物山柰酚、灌木远志酮A、11，14-二十碳二烯酸、花生四烯酸、石竹胺和靶点PTPN1、CYP17A1、PTPN2的度值排名较高，其中山柰酚可以降低癌症、肝损伤、肥胖和糖尿病等慢性疾病的风险，同时对小鼠乳腺肿瘤模型的原发性肿瘤生长和肺转移也有显著的抑制作用[21-22]。PTPN1可以减弱细胞增殖、转移，可能是肺腺癌(LUAD)诊断和治疗的肿瘤标志物或潜在靶点[23]。CYP17A1是一种细胞色素P450酶，可以参与脱氢表雄酮和雄烯二酮的甾体生成，是前列腺癌激素治疗的靶点，同时CYP酶在类固醇激素合成中起着至关重要的作用，CYP17A1基因变异可以引起各种心血管疾病，包括冠心病、心肌梗死、糖尿病和动脉僵硬等[24-25]。附子汤靶点蛋白互作关系网络中，本研究发现CXCR4、ADRA2C、CNR2、ADRA2B、ADRA2A是关键靶点，说明附子汤的药理作用很有可能是这些靶点蛋白相互作用实现的。研究发现，这些靶点蛋白都属于G蛋白偶联受体，它们主要作用于中枢神经系统。其中肾上腺素α2受体与抑制性G蛋白偶联，可以使腺苷酸环化酶失活，减少环磷酸腺苷(AMP)的产生，从而导致动脉血压下降，具有保护心肌的效果[26-27]。该结果与附子汤的作用部位和作用疾病类型结果相吻合，因此，可推断附子汤中的活性成分正是通过以上靶点作用于肝脏和心脏对机体进行调控，从而起到抗炎、抗肿瘤、保肝、改善心功能等作用。

为了进一步说明附子汤相关靶点的信号通路，利用DAVID数据库分析发现主要富集在以下4条通路：神经活性配体-受体相互作用通路、甾体激素生物合成、花生四烯酸代谢和甲状腺激素信号通路。神经活性配体-受体相互作用信号通路主要涉及到DRD1、THRA、THRB、DRD5、OPRK1等靶点，其中多巴胺受体(DRD1-DRD5)主要与大脑功能障碍有关。甾体生物合成是一个复杂的过程，胆固醇在多种酶和辅因子的参与下转化为甾体激素，甾体激素是人体生理过程的重要调节因子，受基因调控[28]。例如，Pott等[29]验证了冠心病单核苷酸多态性与类固醇激素的相关性，并使用孟德尔随机化(MR)方法调查激素水平和CAD状态之间的因果关系，MR结果显示皮质醇、雄烯二酮、17-羟基孕酮和脱氢表雄酮硫酸酯对冠心病均有因果关系，同时还发现冠心病患者中皮质醇和睾酮比正常人明显增加。花生四烯酸(AA)是细胞膜脂的主要成分，主要由环氧合酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450(CYP450)3种酶进行代谢，从而产生不同的炎症反应。花生四烯酸氧化可产生促炎性和抗炎性的类花生四烯酸，对血小板具有活化作用，并且血小板活化在急慢性心血管疾病中也起着重要作用[30]。由此可以推测，附子汤治疗冠心病、慢性心功能不全等心血管疾病，可能是通过以上两个信号通路来实现的。甲状腺激素(TH)基因组和非基因组作用的调控包括细胞生长、胚胎发育、分化、代谢和增殖等几个生理过程，细胞甲状腺激素信号传导的破坏会促进肝癌的发展[31-32]。Wang等[33]发现血清甲状腺刺激激素(TSH)水平升高可以诱发氧化应激相关的肝脏疾病。由此可推测，附子汤对肝脏的保护作用正是通过甲状腺激素信号通路调节实现的。

附子汤作为温补元阳的重要方剂，是回阳救逆、扶正以祛邪方药的化裁基础。在古代附子汤应用广泛，主要用于治疗失眠、月经不调、风湿性关节炎、慢性肾衰竭疑难病的治疗[34-35]。但如今其临床应用少且主要成分及作用机制尚不明确。因此，本研究采用网络药理学的方法，对附子汤的化学成分、相关靶点、作用器官及相关通路的复杂网络进行分析。研究结果表明，附子汤相关靶点的作用器官主要集中于肝脏和心脏，在免疫调节、抗肿瘤、抗炎镇痛、保肝护肝、改善心功能等疾病的治疗中具有较高的临床价值，同时进一步解释了附子汤的重要作用机制，为拓展附子汤的临床定位及应用提供了重要参考依据。