离心分层取材法在血性胸水富集瘤细胞中的应用

曾赛凡， 王雪丹， 陈余朋， 张 声， 王行富

胸膜原发性或转移性恶性肿瘤、各种炎症性病变或肺内病变累及到胸膜时，影响脏/壁层胸膜间皮细胞的液体和蛋白的重吸收及间皮下淋巴管内液体循环，均会导致胸膜腔内液体积聚而形成胸水[1]。恶性胸水呈肉眼血性，含有不同数量的红细胞，掩盖肿瘤细胞，对样本的形态学诊断及后续的免疫细胞化学染色和分子检测等辅助诊断均造成困难。本研究拟探讨离心分层取材法在血性胸水富集瘤细胞中的应用，以提高肿瘤细胞的检出率。

1 临床资料

1.1 材料 收集2019年10月—2020年6月笔者医院诊断为肺腺癌的患者50例，男性33例，女性17例，年龄(45.50±6.50)岁(43～65岁)。所有患者的影像学显示胸膜腔播散产生胸水，超声定位下抽取胸水，留取未经固定的新鲜血性胸水样本。

1.2 方法 收到的样本立即去除肉眼可见的蛋白、血凝块等。分两组进行细胞块制备：

1.2.1 直接离心沉淀法(A组) 摇匀样本取两管各50 mL，2 500 r/min离心5 min，直接取管底沉淀物。

1.2.2 离心分层取材法(B组) 摇匀样本取两管各50 mL，2 500 r/min离心5 min，肉眼观察上清液与沉淀物的分层情况，有分层的再次观察沉淀物大小及移动情况。沉淀物<2 mL，取全部管底沉淀物；沉淀物>2 mL且固定在管底不移动，取沉血表面物；会移动的可行沉淀物与破红液(10%中性缓冲福尔马林与50%乙醇等量混合液[2])1∶1混匀破红处理；无法分层的取10 mL样本与破红液按1∶4混匀破红，均取破红析出物。

两组材料获得的管底沉淀物、沉血表面物、破红析出物等沉淀物均加入10%中性缓冲甲醛50 mL悬浮固定5 min，1 500 r/min离心5 min后去上清液，加75%乙醇50 mL混匀立即离心，1 500 r/min离心5 min后去上清液，95%乙醇缓慢的沿试管壁加入，室温静置2 h，细胞凝集成块取出，用绵纸包裹，脱水包埋制成细胞蜡块，切片厚度4 μm，行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin stain，H-E)及免疫细胞化学染色(immunocytochemical stain，ICC)。ICC检测指标：甲状腺转录因子1(TTF-1，1∶200，8G7G3/1，鼠单抗，北京中杉金桥生物技术有限公司，细胞核)、天冬氨酸蛋白酶A(NapsinA，1∶200，MX015，鼠单抗，福州迈新生物技术有限公司，细胞质)。采用ULtraVIEW两步法检测系统进行检测，全自动免疫组织化学染色仪(Roche BenchmarkXT，瑞士罗氏公司)中完成免疫组织化学染色。

1.3 评判标准 由两位副主任医师阅片。两组切片的染色结果以红细胞背景、细胞集中、形态完整、抗原良好 4个方面给予评价，结果以χ2检验进行分析。P<0.05为差别具有统计学意义。

1.4 结果 A组管底沉淀物细胞蜡块H-E切片染色可见大量红细胞聚集，有核细胞分散，数量少；免疫细胞化学染色TTF-1、NapsinA中肿瘤细胞表达量极少(图1)。B组中管底沉淀物(B1)细胞蜡块H-E切片染色可见：少量的红细胞散落在肿瘤细胞旁边，肿瘤细胞形态完整，核浆分明；沉血表面物(B2)可见：红细胞量较多，但未影响肿瘤细胞的显现，肿瘤细胞成腺管样排列；破红析出物(B3)可见：红细胞未见或极少量，肿瘤细胞集中，形态完整；B组免疫细胞化学染色TTF-1、NapsinA中表达清晰、定位准确、背景干净(图1)。两组的红细胞背景、细胞集中、形态完整、抗原良好 4个方面检出例数及所占总数的比例比较，差别具有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 两组取材法结果比较

A组管底沉淀物：Aa：H-E染色红细胞聚集，有核细胞分散，数量少；Ab-Ac：NapsinA及TTF-1中肿瘤细胞表达量极少。B组管底沉淀物(B1)：B1a：H-E染色，红细胞散落在肿瘤细胞旁边，肿瘤细胞形态完整，核浆分明；B1b：NapsinA细胞质棕黄色表达；B1c：TTF-1细胞核棕黄色表达；B组沉血表面物(B2)：B2a：H-E染色，红细胞量较多，但未影响肿瘤细胞的显现，肿瘤细胞成腺管样排列；B2b：NapsinA细胞质棕黄色表达；B2c：TTF-1细胞核棕黄色表达；B组破红析出物(B3)：B3a：H-E染色，红细胞未见或极少量，肿瘤细胞集中，形态完整；B3b：NapsinA细胞质棕褐色表达；B3c：TTF-1细胞核棕褐色表达。

2 讨 论

肺腺癌转移至胸膜所产生的血性胸水肉眼可呈现深浅不一的红色，其中的红细胞常和有核细胞及蛋白黏液等成分混合，干扰了有核细胞的分离。解建军等[3]用3%乙酸乙醇处理血性积液，乙酸对有核细胞的膨胀和乙醇对有核细胞的收缩可以相互抵消，对于离心分层后沉淀物会移动的血性胸水中呈现红细胞溶解，背景干净，但在无法分层的血性胸水中乙酸溶解红细胞的碎片会加深染色的背景。本研究预实验发现，使用乙酸单独或混合液作为破红处理剂的病例，TTF-1抗体细胞核标记无或极少表达，可能是乙酸快速的沉淀核蛋白导致TTF-1蛋白丢失。朱启淦等[4]用新柏氏细胞清洗液溶解红细胞，此类清洗液主要是含醇类的成分，对于离心分层后沉淀物会移动的血性胸水去除红细胞，富集有核细胞的效果良好；但醇类会沉淀无法分层的血性胸水中肉眼看不见的蛋白等，使得肿瘤细胞分散，细胞轻度收缩。笔者采用50%乙醇液+10%中性缓冲甲醛混合液处理[2]，主要是应用50%乙醇裂解红细胞和10%中性缓冲甲醛固定有核细胞同步作用于无法分层的样本，呈现红色的上清液和灰白色的沉淀物分离。灰白色的沉淀物中残留少量的红细胞，通过10%中性缓冲甲醛再次固定有核细胞和梯度乙醇凝集的重复清洗，获得破红析出物。B组较A组细化了血性胸水样本离心后，针对沉淀物的分层、大小、状态等差异情况采用相对应的取材方式，镜下观察该组的细胞块切片，H-E染色有核细胞形态完整，尤其是肿瘤细胞集中，抗原表达良好。

任何体液样本富集细胞都需要离心这一步骤。离心技术原理是红细胞比重较有核细胞大，所以红细胞沉积于最底层，有核细胞分布于红细胞层和上清液之间。离心的目的是为了体液样本中的液体和细胞脱落物等成分形成沉淀和上清液，又不破坏细胞的形态。所以，合适的离心转速和时间非常重要，需要反复实验摸索。对于血性样本，本研究首次离心采用 2 500 r/min离心 5 min；取材后制作细胞蜡块前离心采用1 500 r/min离心5 min，较高转速时红细胞分层，较低转速时有核细胞聚集。红细胞量较少的样本离心后有核细胞和红细胞均沉积于管底形成淡红色的管底沉淀物，此类样本中少量的红细胞不影响有核细胞的呈现；离心后沉淀物>2 mL且为深红色的沉血时取沉血表面物，吸取时应动作缓慢，避免多量的红细胞与有核细胞同时被收集；多量的红细胞游离于内容物比较少的体液中，使得离心后沉淀物移动；大量的红细胞和体液中的内容物混合，使得样本离心后无法分层，这两种均需破红处理方可出现分层，获得有效细胞。

细胞蜡块富集瘤细胞，可以提供优良的细胞保存和免疫细胞化学染色及分子检测的细胞学材料[5]，所以，目前细胞蜡块在细胞学领域广泛使用。TTF-1和NapsinA对于肺腺癌的诊断具有较好的特异性和敏感性[6]。本研究使用这两个指标进行抗原验证，在细胞蜡块肿瘤细胞检出的基础上进行免疫细胞化学染色，结果显示抗原表达均良好。但样本送检时应新鲜，未经固定且去除肉眼可见的蛋白、血凝块等，因为固定后有核细胞与肉眼可见物包裹，离心时沉积于管底最底层，影响离心分层取材位置的判断。样本处理的及时性可减少细胞在体外的退变，多次的送检可增加细胞收集量且宜于进行形态学比对。血性胸水的离心分层取材法最大限度地富集有核细胞，尤其是肿瘤细胞的富集量明显增多，值得临床推广应用。