响应面法优化槐米中芦丁的提取工艺研究

姚佳，潘利平，龙应霞，张欢欢

（黔南民族师范学院 生物科学与农学院，贵州都匀 558000）

槐米为豆科植物槐（Sophora japonciaL.）的干燥花蕾，槐米中富含芦丁和槲皮素等黄酮类成分，其中主要活性成分为芦丁[1]。芦丁具有抗病毒、舒张血管、抗自由基活性、抗脂质过氧化、拮抗血小板活化因子聚集、抗急性胰腺炎、胃溃疡的预防性保护等作用，医药工业中常以槐米为主要原料提取芦丁，销往日本、东南亚和欧美等国家和地区[2-3]。

已有研究人员分别采用水提法、碱溶酸沉法、超声波法等方法提取槐米芦丁，并采用正交法、响应面法考察了槐米粉碎度、提取时间、溶剂用量、提取次数、超声波功率以及料液比等因素对芦丁得率的影响[4-9]。目前还没有超声波辅助碱溶酸沉法提取槐米芦丁的报道，因此本研究通过考察超声波时间、酸沉pH值、超声温度等因素对芦丁提取的影响，以期找到一条稳定可靠的芦丁提取工艺。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

槐米，安国市旭芳中药材经营有限公司；浓盐酸，分析纯，固安县金荣化工有限公司；生石灰，购自都匀市场。

pH838测试笔，希玛仪表；CJ-G040超声波提取器，深圳市超洁科技实业有限公司；FCR2002-UF-P超纯水机，青岛富勒姆科技有限公司；GXZ-9140MBE鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH-S6型数显恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；CP214分析天平，奥豪斯仪器有限公司；ZA-2型粉碎机，金坛市科析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁的提取

取干燥槐米30 g，粉碎，过100目筛，加入澄清石灰水，超声提取，趁热抽滤，取滤液，浓盐酸调节pH值，室温静置，抽滤，得黄色沉淀，用水洗涤至中性，冷冻干燥得粗芦丁，将干燥后的粗芦丁加入一定量的蒸馏水，用饱和石灰水调pH值至8～9，充分溶解后趁热抽滤，滤液加浓盐酸调节pH值2左右，静置，冷却后抽滤，并用蒸馏水洗至中性，烘干后得精制芦丁，称重，计算芦丁得率。

其中：m为提取芦丁质量，g；M为槐米质量，g。

1.2.2 单因素试验

通过查阅文献和前期试验摸索，称取30 g槐米粉末，以芦丁得率为响应值，探究超声时间（10 min、20 min、30 min、40 min和50 min）、酸沉pH值（1.0、2.0、3.0、4.0和5.0）、超声温度（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃）3个单因素对芦丁得率的影响，确定各因素对芦丁提取的最佳范围。

1.2.3 响应面设计

在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 11.0软件，选择超声时间（A）、酸沉pH值（B）、超声时间（C）3个因素为因变量，芦丁提取率（Y）为响应值，设计3因素3水平的Box-Behnken实验，合计12个析因点，3个中心重复试验，共计15次试验进行芦丁提取的优化，结果再进行方差分析，考查试验的可行性，最后通过预测和试验验证优化工艺的可行性和准确性。

1.2.4 数据和图形处理

每个单因素试验随机重复3次，结果均以均值±标准差（±s）表示，单因素试验结果采用Origin 2018对实验数据进行方差分析和图形处理，响应面优化采用Design-Expert 11.0软件进行响应面设计、方差分析和结果预测。

1.2.5 验证实验

采用Design-Expert 11.0软件预测的试验工艺，进行3次平行实验，取平均值，计算标准差，以验证模型是否可靠，进而得到最优结果。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

固定超声温度100 ℃、酸沉pH值3，由图1（a）可知，浸提时间在10～40 min时，随着时间的推移，芦丁提取率逐渐升高，在40 min时，芦丁提取率达到最大值，然后随着时间的增加芦丁提取率降低，因此选择40 min作为芦丁的最佳浸提时间。

图1 超声时间、酸沉pH值、超声温度对芦丁提取率的影响

固定超声提取温度100 ℃、提取时间40 min，由图1（b）可知，当pH值为1.5时芦丁的提取率最高，同时通过调节pH发现，当pH＜3时出现絮状物现象最为明显，因此单因素试验的范围选择在pH值1.0～2.5，并选择pH为1.5作为芦丁提取的最适pH。

固定超声提取时间40 min，酸沉pH 1.5，研究不同提取温度对芦丁提取率的影响，结果如图1（c）所示。在温度60～70 ℃，芦丁的得率变化较小，70～80 ℃略有增加，80～90 ℃后急剧增加，100 ℃后又降低，说明温度对芦丁的提取影响比较大。单因素试验表明：超声时间为40 min，酸沉pH为1.5，提取温度90℃时为较优参数，可作为响应面的设计优化的试验基础。

2.2 响应面实验结果

采用-1、0、1进行编码，以超声时间（A）、酸沉pH值（B）、超声温度（C）为因素变量水平，芦丁得率（Y）为响应值，利用Design-Expert 11.0版本软件进行实验设计，各因素编码水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素及编码水平设计

根据Box-Behnken Design试验因素及编码水平，设计12个析因点实验，3个中心重复实验，设计方案及实验结果如表2。

表2 Box-Behnken实验设计及实验结果

对表2进行回归模型方差分析，结果见表3。从表3可知，回归模型的P＜0.05，回归模型显著，说明芦丁得率与超声时间、酸沉pH值、超声温度的二次多项式回归模型方程可用；失拟项的P＞0.05，失拟项不显著，说明方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，芦丁得率与超声时间、酸沉pH值、超声温度关系良好。

表3 回归模型的方差分析

通过回归分析，得到二次多项回归模型方程为：Y=11.3-0.3353A-0.2043B+0.3465C+0.7078AB+0.5472AC+0.1147BC-2.47A2-2.52B2-3.43C2。

采用Design-Expert 11.0版本的软件，做3D响应面分析得到图2。由图2可知，超声时间与酸沉pH值、超声时间与超声温度、酸沉pH值与超声温度之间均出现了先增加后降低的趋势，3D响应面图中均出现了爬坡最高点，3D响应面在底面的投影为二维等高线图，由底部的二维等高线图可知，等高线均出现了圆形或椭圆形，芦丁的提取具有最高中心点，说明响应面提取芦丁优化完成，可以进一步采用该方法进行提取芦丁的优化预测。

图2 超声时间、酸沉pH值、超声温度相互之间的3D响应面图

2.4 芦丁工艺优化预测与验证试验结果

采用Design-Expert 11.0中的Optimization（优化）功能，芦丁得率目标期望获得最大值，超声时间、酸沉pH值、超声温度均选择在一定范围内，在该模式下，预测工艺为超声时间39.295 min、酸沉pH值1.475、超声温度90.444 ℃，芦丁期望值为11.323%。为方便试验，选择超声时间39 min，酸沉pH值1.5，超声温度90 ℃，通过3次工艺试验验证，芦丁提取率为（10.329±1.961）%。

如果希望尽可能节约能量资源而获得较高的芦丁提取率，工艺中温度与时间越低，消耗的能量就越低，因此Optimization（优化）功能下还可以选择超声时间和超声温度的优化目标选择最小取值范围，酸沉pH值与能量无关，选择在设置范围内，芦丁得率目标期望得率选择最大范围内。在该模式下，预测工艺为超声时间32.553 min、酸沉pH值1.421、超声温度84.905 ℃，芦丁提取率期望值为9.379%。通过试验验证，选择超声时间33 min，酸沉pH值1.4，超声温度85 ℃，芦丁提取率为（9.113±0.139）%，对槐米中的芦丁仍然具有较高的提取率。

3 结论

通过单因素试验设计，筛选获得超声辅助提取法中超声时间、酸沉pH值、超声温度为影响芦丁得率的关键因子，再利用响应面联合Box-Behnken试验设计和Optimization获得两条优化工艺，优化工艺为超声时间39 min、酸沉pH值1.5、超声温度90 ℃，通过3次工艺试验验证，芦丁提取率为（10.329±1.961）%。经验证，响应面优化获得槐米芦丁的提取工艺稳定可靠。