第二类医疗器械口腔溃疡含漱液的生物学评价研究

王铸辉，吴静红，肖本友，李健和

(1.湖南省医疗器械检验检测所，湖南 长沙 410014；2.康多宝医疗健康产品(湖南)有限公司，湖南 长沙 410010；3.中南大学湘雅二医院药学部，湖南 长沙 410011)

0 引言

国外Access Pharmaceuticals,Inc.公司以苯甲醇为主要成分开发上市了口腔溃疡含漱液，并以第二类医疗器械在我国进口注册上市，注册号为：国食药监械(进)字2012第2630299号，商品名：妙固(MuGard)，组成成分为水、卡波姆均聚物A、甘油、糖精钠、磷酸、柠檬酸、苯甲醇、氢氧化钾、聚山梨醇酯60，其中苯甲醇浓度为1.5%，适用于预防和治疗各种口腔黏膜炎、口腔溃疡(复发性口腔溃疡或手术、假牙、正畸等引起的创伤性溃疡)，预防和治疗各种放化疗性口炎。国内外文献[1-6]报道的临床应用情况显示：口腔溃疡含漱液用于缓解口腔溃疡及口腔炎症创面所带来的疼痛，安全有效；对治疗头颈部放疗患者口腔黏膜炎有很好的预防及治疗效果。据此，我们也研制开发了第二类医疗器械口腔溃疡含漱液，现将其生物学评价研究结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器

AE200电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；Thermo 311 二氧化碳培养箱(美国赛默飞世尔科技公司)；BSC-100IIA2生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司)；XDS-1倒置显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)；WMK-02隔水式恒温培养箱(山东潍坊精鹰医疗器械有限公司)；Plus 384酶标仪(美国 Molecular Devices公司)。

1.2 试药

口腔溃疡含漱口液(康多宝医疗健康产品(湖南)有限公司，批号：20190111)；MTT溶液(北京索莱宝科技有限公司)；DMSO溶液(CALBIOCHEM公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；1640培养基(GIBCO公司)；氯化钠注射液(湖南科伦制药有限公司)；弗氏完全佐剂(CFA)(SIGMA公司)；植物油(山东鲁花集团有限公司)。

1.3 动物

普通级实验兔，体重2.0-2.5kg，武汉市万千佳兴生物科技有限公司提供；白色豚鼠，体重350-500g，武汉市万千佳兴生物科技有限公司提供；ICR小白鼠，SPF级，体重18-22g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 细胞毒性试验

(1)试验方法[7]

细胞培养液的制备：使用前将分装好的胎牛血清50mL加入1640培养基至500mL，混匀。

供试液的制备：取无菌样品3.08g，按1:40比例加入123.2mL含血清细胞培养液，37℃±1℃条件下放置24h制备浸提液。

阴性对照液：高密度聚乙烯浸提液。

阳性对照液：5%DMSO的细胞培养液。

细胞混悬液的制备：取正常培养的L-929细胞，消化吹打计数，平均为183×104个/mL。将0.3mL细胞混悬液加入培养液中至54.9mL，稀释至183倍，浓度为1×104个/mL。吸100μL细胞混悬液注入培养板内。放入含5%的二氧化碳恒温培养箱中培养24h。弃去原培养液，每孔分别加入100μL的空白对照液、阴性对照液、阳性对照液、试验样品浸提液，每组设8孔。分别于72h后弃去孔内的液体，每孔加入20μL浓度为5g/L的MTT溶液，在二氧化碳恒温培养箱中培养4h。弃去孔内的液体，每孔分别加入150μL DMSO溶液，10min后振荡，在酶标仪上用双波长(570nm和630nm)法测定吸光度。计算细胞相对增殖度(relative growth rate，RGR)，RGR=供试品(阴性、阳性组)吸光度/空白对照组吸光度×100%，并判断细胞毒性级别。RGR分级如下：分级为0、1、2、3、4，对应的相对增殖度为≥100、80-90、50-79、30-49、0-29。

(2)结果

根据标准规定，试验组相对增殖度为0级或1级为合格；试验组相对增殖度为2级，应结合形态综合评价，轻微毒或无毒的为合格；试验组相对增殖度为3级-4级为不合格。由表1可知，供试品的细胞毒性为1级，为合格。

表1 细胞毒性实验结果

2.2 皮内反应试验

(1)试验方法[8]

供试液制备：取口腔溃疡含漱液4.08g，放入一玻璃器皿中，加入0.9%氯化钠注射液20.4mL，封闭后置压力蒸汽灭菌器内121℃浸提1h，即得供试品浸提液。

空白对照液：0.9%氯化钠注射液。

取试验兔雌雄各1只，体重2.0-2.5kg，要求无任何皮肤病或损伤，未做过任何试验。实验前24h在兔脊柱两侧各剪剃5cm×15cm区域兔毛，避免损伤皮肤。试验时用75%乙醇清洁暴露皮肤，在每只兔脊柱一侧的10个点，皮内注射0.2mL供试品浸提液，在每只兔脊柱一侧的5个点，皮内注射0.2mL空白对照液，注射后24h、48h和72h，观察注射局部及其皮肤组织反应，包括红斑、水肿和坏死等，进行皮肤刺激性评分，见表2，计算原发性记分与原发性刺激指数(PII)。供试品浸提液记分减去空白对照液记分为每只兔的原发性刺激记分，每只兔原发性刺激记分相加再除以兔总数为原发性刺激指数(PII)，按原发性刺激指数(PII)：0.0-0.4、0.5-1.9、2.0-4.9、5.0-8.0划分相应反应等级：无、轻度、中度、重度。

表2 皮肤刺激性反应评分标准

(2)结果

口腔溃疡含漱液注射于试验兔后24h、48h、72h，供试品浸提液记分均为0分、空白对照液记分均为0分、原发性刺激记分均为0分、原发性刺激指数均为0分，肉眼观察试验兔均未见红斑、水肿及坏死现象，口腔溃疡含漱液对动物机体无皮内刺激反应。

2.3 皮肤致敏性试验

(1)试验方法[9]

供试液制备：取口腔溃疡含漱液4.0g，放入一玻璃器皿中，加入0.9%氯化钠注射液20mL，置压力蒸汽灭菌器内121℃灭菌60min，即得供试品浸提液。将供试品浸提液、阴性对照液、5%甲醛阳性对照液与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合，用力搅拌数分钟至完全乳化为止。

将白色豚鼠30只随机分为3组，每组雌雄各半，试验前24h剃除豚鼠肩胛骨内侧部位4cm×6cm区域毛发。试验时用75%乙醇清洁豚鼠背部去毛区，在每只豚鼠去毛区做6点对称的皮内注射。靠头部2点部位A：注射弗氏完全佐剂与选定的溶剂等体积混合的稳定性乳化剂。中间2点部位B：注射未经稀释的浸提液试验样品；对照组仅注射相应溶剂。靠尾部2点部位C：试验样品与弗氏完全佐剂和溶剂等体积混合的稳定性乳化剂。各点相距1-2cm，每点注射量为0.1mL。皮内注射后7d，在注射部位再次剃毛，用75%乙醇清洁。若未出现刺激反应，每一试验区用10%十二烷基硫酸钠石蜡液预处理，在局部斑贴前24h涂抹、按摩试验区皮肤。24h后将2cm×4cm滤纸浸入供试品浸提液(部位B采用的浓度)或阴性对照液、阳性对照液至饱和，将其贴敷于豚鼠背部注射部位，封闭固定48h。

于诱导完成14d，在豚鼠上腹侧未实验部位剃毛，用75%乙醇清洁，将2cm×2cm滤纸浸入供试品浸提液(按部位C选定的浓度)或阴性对照液、阳性对照液至饱和，将其贴敷于剃毛区，封闭固定24h。将贴敷物取下后24h和48h，分别观察豚鼠激发部位皮肤情况，按如下给出的Magnusson和Kligman分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行分级，敷贴试验反应：无明显改变、散发性或斑点状红斑、中度融合性红斑、重度红斑和水肿，其相对应的等级分别为：0、1、2、3级。

2 结果

试验期间豚鼠无任何异常表现，没有中毒症状，也没有豚鼠死亡。阴性对照组和供试品组激发后1h、24h、48h均未出现红斑和水肿，致敏试验为阴性。而对照组激发后1h、24h、48h均出现中度、重度红斑和水肿，致敏试验为阳性。在本试验条件下，口腔溃疡含漱液对动物机体无致敏反应。

2.4 急性全身毒性试验

(1)试验方法[10]

供试液制备：取口腔溃疡含漱液4.0g两份置浸提器内，其中一份加入0.9%氯化钠注射液20mL，另一份加入植物油20mL，置37℃±1℃恒温箱中，于24h内使用。同法制备介质对照液。

取雌雄各半小白鼠10只，随机分为试验组和对照组，经尾静脉分别注射氯化钠浸提液和介质对照液，注射量：0.5mL/10g，注射速度：0.1mL/s。另取10只由腹腔分别注入植物油浸提液和介质对照液，注射量：0.5mL/10g。注射完毕后，观察小白鼠即时反应，并于4h、24h、48h、72h观察和记录试验组和对照组的一般状态、毒性表现和死亡动物数。注射后动物反应观察指标见表3。

表3 注射后动物反应观察指标

(2)结果

试验组和对照组的氯化钠浸提液、试验组和对照组的植物油浸提液分别注射于小白鼠体内，即时反应、4h、24h、48h、72h观察都无毒性症状，体重也并未下降。根据标准规定，在72h观察期内，试验组动物的反应不大于对照组动物，则判断供试品合格。因此，口腔溃疡含漱液无急性全身毒性反应。

3 讨论

生物学评价研究在于预测产品使用过程中对机体带来的潜在危害性，试图提供安全信息，将不安全的风险减少到最低程度。对口腔溃疡含漱液的生物学评价研究包括细胞毒性试验、皮内反应试验、皮肤致敏试验以及急性全身毒性试验，以保证产品的质量和临床使用的安全性。

本课题成功制备了口腔溃疡含漱液，其配方合理，制备工艺简单可行，质量可控，稳定性、安全性良好，抑菌作用显著，本品的研制成功将对多种口腔致病菌和非致病菌有抑制和杀灭作用。本品用于缓解口腔溃疡及口腔炎症创面所带来的疼痛，安全有效；对治疗各种口腔黏膜炎、口腔溃疡(复发性口腔溃疡或手术、假牙、正畸等引起的创伤性溃疡)、各种放化疗性口炎有很好的预防及治疗效果。