血mmp-13和Toll样受体2在单核细胞中的表达预测 宫内感染的价值

王蕾，曾凤梅，张丽珠，李小永，柳玉红

(深圳市宝安区人民医院产科，广东 深圳 518101)

0 引言

胎膜早破(PROM)是妊娠常见的并发症，发生率超过20%。感染是胎膜早破的主要原因[1]。绒毛膜羊膜炎是早产的常见原因，可能导致不良的新生儿结局，包括神经发育后遗症[2]。绒毛膜羊膜炎已被标记为以感染或炎症或两者兼有为特征的多种疾病，其次是母亲及其新生儿的临床实践[3]。早产在临床中显示是围产期增加死亡人数及长期发病率的主要原因。最近一项对871例妊娠的前瞻性研究发现，患有组织学绒毛膜羊膜炎的人，早产的发生率几乎是没有绒毛膜羊膜炎的人的两倍[4]。本文检测了胎膜早破产妇胎膜中的MMP-13及TLR2在单核细胞中的表达，同时探究其在宫内感染中预测的价值，进而提高患者生活质量。为早期诊断宫内感染患者诊断提供可靠、全面的医学依据，同时也有利于临床上的规范诊疗，具有巨大的经济和社会效益。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

将2020年6月至2021年3月期间在我院进行住院的胎膜早破产妇40例及足月无早破初产妇30例，根据病理检查有无绒毛膜羊膜炎将产妇分为感染组,28例及非感染组12例。其中感染组别产妇28例，年龄23～36岁，平均年龄为(28.9±2.5)岁，孕周为(35.2±0.9)周，非感染组别产妇12例，年龄22～36岁，平均年龄为(28.1±2.2)岁，孕周为(37.8±1.4)周，对照组为正常产妇30例，年龄23～37岁,年龄(27.8±2.2)岁，孕周为(39.4±1.1)周，两组一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

纳入标准：符合以下标准的人被纳入本次研究中，有明确的妊娠年龄，单胎，28-36个孕周，和(或)存在早期羊膜囊破裂，生殖和泌尿道感染。入选的产妇均无高血压、心脏病、糖尿病、肝炎、肿瘤等病史。本研究经我院伦理委员会批准。患者及其家属知情同意并签署同意书。诊疗过程严格遵循伦理原则，确保患者隐私和安全。将患者分为感染组和非感染组。对照组：孕龄，单胎，无子宫收缩，37周内无分娩。

排除标准：病理性妊娠，例子妊娠期高血压病症、妊娠期肝内胆汁淤积病症、前置胎盘、胎盘早剥、糖尿病、甲亢等内外科疾病。

1.2 诊断标准

临床诊断绒毛膜羊膜炎：母体发热、母体及/或胎儿心动过速、母体白细胞增多、子宫压痛、恶臭或脓性羊水。高倍镜下中性粒细胞浸润>5例，实验室指标：白细胞计数>15×109/L，中性粒细胞百分比>0.80，胎盘培养阳性，胎膜炎性表现病理检查，如有以上两种情况，诊断为感染。

1.2 方法

禁食8h以上后，早晨采集静脉血3mL和edta 抗凝1mL。收集单核细胞，检测 toll 样受体2的表达。其余送实验室测定CRP。胎盘娩出后，严格无菌操作，取出大于4cm 的胎膜大小约为2cm×2cm×1cm。经过浓度为10%的甲醛稳定，将胎膜送病理检查。(1)TLR2的检测① 采集2份50μL EDTA抗凝的外周血标本，浸入5mL流动管底；② 加入5μL人CD14/PE抗体进行单核细胞校准，2.5μL人TLR4/FITC抗体与全血混合检测TLR2表达；③ 另一管用5μL CD14/PE抗体进行单核细胞校准。将5μL IgG2a/FITC抗体的同源对照品加入流式细胞仪底部，与全血混合。细胞在室温黑暗中培养20分钟；④ 在两个试管中分别加入250μL optilyse C。混合后，试管避光10分钟，以溶解红细胞，直到液体变透明；⑤ 将LML-PBS洗涤液加入两管后，轻轻混合，然后将样品管放入离心机中，以1500rpm分离5分钟，然后丢弃上清液；⑥ 向细胞沉淀中加入2mL PBS洗液，然后在1500rpm下丢弃上清液5min；⑦ 加入500μL PBS洗液后，轻轻混合，用上流式细胞仪检测；⑧ 结果：TLR2蛋白在单核细胞表面有表达。⑨ 实验结束后采用SPSS 25.0软件进行数据分析。(2)血清MMP-13水平检测：采用双抗体夹心ABC酶联免疫吸附试验(ELISA)和thermo multiskan MK3自动酶标仪检测血清MMP-13水平，严格按照试剂盒说明书操作。采集两个观察者的切片在显微镜下观察，根据黄色反映的阳性强度及面积来判断结果，若阳性细胞的阳性强度分为无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色，则分别对应计分为0、1、2、3分，最后应用免疫组织化学积分计算总和。

1.3 观察指标及诊断标准

胎膜早破合并感染组、胎膜早破无感染组和对照组母外周静脉血中TLR2水平及mmp-13比较.

1.4 统计学分析

采用SPSS 25.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用(±s)表示，组间比较采用t检验，组内比较采用配对t检验；计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 每组孕妇血清及羊水MMP-13水平比较

结果显示感染组母体血清及羊水的MMP-13表达水平均显著高于非感染组，组间差异有统计学意义(P<0.05)。具体数据详见表1。

表1 感染者及非感染者的MMP-13水平对比情况(±s，ng/L)

表1 感染者及非感染者的MMP-13水平对比情况(±s，ng/L)

组别 例数 MMP-13血清 羊水感染组 28 382±105 95±28非感染组 12 153±80 68±25 t 6.744 2.881 P 0.000 0.007

2.2 三组产妇静脉血收集的单核细胞表面TLR2蛋白水平的对比

结果显示胎膜早破合并感染组外周血TLR2细胞显著高于胎膜早破非感染组及正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，而无绒毛膜羊膜炎者TLR2细胞与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 三组产妇静脉血收集的单核细胞表面TLR2 蛋白水平的对比(±s，%)

表2 三组产妇静脉血收集的单核细胞表面TLR2 蛋白水平的对比(±s，%)

组别 例数 TLR2感染组 28 12.2±4.52非感染组 12 1.98±0.25对照组 30 2.12±0.26 t 5.362 P 0.001

3 讨论

基质金属蛋白酶是一类锌依赖蛋白水解酶，负责切割多种ECM蛋白。它们主要分为胶原酶(MMP-1，-8，-13和-18)，明胶酶(MMP-2和-9)，膜型MMP(MMP-14，-15，-16，-17，-24和-25)和 其 他(MMP-7，-12，-19，-20，-23，-26和-28)。MMP是具有高度保守的信号肽，前肽域和催化域的多域蛋白[5]。除MMP-7，-23和-26外，所有MMP还包含富含脯氨酸的铰链区和C端血红素样结构域。由于MMP-13在OA中起着至关重要的作用，它已成为研究人员关注的热点。如果能够检测或合成能够阻断MMP-13转录调控途径中特定步骤，抑制其合成或与MMP-13结合以抑制其生长的物种，则或许能够治疗OA它的活动[6]。这种物质称为MMP-13抑制剂。结果显示感染组母体血清及羊水的MMP-13表达水平均显著高非感染组，MMP-13在感染细组中的表达显著高于宫体部，研究表明胎膜宫颈部的结构较为复杂且宫体部薄弱，可推测出MMP-13在胎膜宫颈部的高度表达影响了产妇部分胶原降解速度，使其速度加快，进而破坏底膜，加速了细胞凋亡，韧性降低最终导致宫颈部胎膜破裂，MMP-13的表达水平与孕周之间呈负相关，说明表达水平越高，胎膜破裂时间越早，感染率越高。MMP-13可调控细胞外基质含量和胎膜结构,引起胎膜结构弱化,从而导致胎膜早破[7-8]。MMP-9在孕中期含量甚微,但在破膜、分娩及宫内感染的羊水中明显升高。

Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)作为脂多糖的跨膜信号受体，启动革兰氏阴性菌的天然免疫应答，是天然免疫和获得性免疫之间的重要桥梁[9]。TLRs在急性炎症、细胞信号转导和细胞凋亡中起重要作用[10]。大多数研究集中在TLR-2和TLR-4上。本文比较了感染组和非感染组别的TLR-2mrna水平，结果表明，TLR-2mrna在感染组别早期显著升高，提示机体激活了TLR信号转导通路，产生炎症介质，胎膜早破宫内感染早期诱导抗感染防御机制及免疫应答的研究。巨噬细胞作为TLR2蛋白的信号转导子，在免疫细胞的促炎症反应中起重要作用，主要作用于革兰氏阴性菌。其意义体现在胎膜早破后导致新生儿出现宫内感染早期机体已经通过激活TLR信号传导途径，出现了炎症介质，诱导抗感染防御机制及免疫应答反应。早期羊膜囊破裂可以增加宫内感染的速度和范围。机体对感染产生免疫反应，使单核巨噬细胞聚集，并在病原菌的作用下诱导TLR2的表达，起到抗感染的作用。

综上所述，血MMP-13及TLR2在单核细胞中的表达与胎膜早破发生之间有着密切关联,均显示高表达，可为后续临床预测提供支持。作为感染标记物在预测宫内感染时有重要意义，在临床中增加了一项可靠指标。