珍珠龙胆石斑鱼优势腐败菌的分离鉴定及抑菌试验

于淑池，吴 静，梁宇晴，李 烨，邢文君，周玲玲

(海南热带海洋学院 食品科学与工程学院，海南 三亚 572022)

0 引言

茶多酚(Tea polyphenols TP)作为植物源天然抗氧化剂，具有安全性高、抗菌性强、无毒副作用等特点，在食品保鲜领域应用较为广泛[10]，目前茶多酚对水产品腐败菌的抑制作用报道较少[11]9,[12]44,[13]。本研究首先确定4 ℃冷藏珍珠龙胆石斑鱼的货架期，通过传统培养基法结合16S rDNA技术分离鉴定货架期终点的优势腐败菌，以茶多酚为抑菌剂，探讨其对冷藏珍珠龙胆石斑鱼优势腐败菌的抑菌作用，以期为珍珠龙胆石斑鱼腐败菌的靶向抑菌、延长货架期提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

珍珠龙胆石斑鱼(体质量740±16 g)：采购于三亚市荔枝沟路乐天城农贸市场。

培养基及试剂：平板计数培养基(PCA)，北京陆桥技术股份有限公司；营养琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母提取物，广东一品鲜生物有限公司；茶多酚(纯度>99%)，食品级，河南千志商贸有限公司。

仪器：SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；BCD-649WE型冰箱，青岛海尔股份有限公司；SQ510C型立式压力蒸汽灭菌器，重庆雅马拓科技有限公司；250B数显生化培养箱，金坛市盛兰仪器制造有限公司；Universal Hood II 凝胶成像仪、DYY-10C型电泳仪，BIO-RAD 中国公司；BSA-2224S型电子天平，斯沃德北京仪器设备有限公司。

1.2方法

1.2.14 ℃冷藏珍珠龙胆石斑鱼货架期的测定

购买鲜活珍珠龙胆石斑鱼运回实验室，致死后放在碎冰上进行“三去”(去头、去鳞、去内脏)处理后，用刀沿背脊部剖为两半后取脊背肉，并切成重量为20 g 左右的鱼片；用自封袋密封后置于4 ℃冰箱贮藏，每隔2 d取样，对珍珠龙胆石斑鱼片的感官品质、总挥发性盐基氮(TVB-N) 、菌落总数和pH 指标进行测定，每种样品平行处理3次，取均值。

感官评价参照于林等[14]对石斑鱼的感官评价方法，10名经过培训的评定员，每隔2 d对珍珠龙胆石斑鱼片的色泽、气味、弹性和组织形态进行感官评分，以4个项目评分总和的算术平均值作为感官评分结果，6分以下为感官临界点；挥发性盐基氮指标的测定参照GB 5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法进行；菌落总数测定参照国标 GB 47892-2016《菌落总数的测定》的标准；pH测定参考蓝蔚青等[15]226的方法进行。

1.2.24 ℃冷藏珍珠龙胆石斑鱼腐败菌的分离纯化与鉴定

(1)腐败菌的分离纯化

参照文献[16-17]方法进行腐败菌的分离纯化。根据货架期的测定结果，无菌条件下取货架期终点冷藏的珍珠龙胆石斑鱼肉20 g加入180 mL生理盐水(无菌)均质，进行10倍比稀释，选取10-1～10-6稀释梯度，每个稀释度吸取100 μL涂布于平板计数琼脂培养基PCA平板上，倒置于30 ℃恒温培养箱培养48 h；选取菌落数分散比较均匀的平板，观察并记录菌落特征，同时进行革兰氏染色、接触酶测试，并计算同种菌落细菌占菌落总数的比例，进一步挑取典型的单菌落，重复平板划线至少3次以上，得到纯化的单菌落。进一步进行16S rDNA序列分析。

(2)16S rDNA 分析

将货架期终点纯化得到的占比较高的3株腐败菌进行菌落PCR，以检测是否为纯种；向1.5 mL离心管中加入双蒸水1 μL，用小移液管的尖头处蘸取单菌落接进双蒸水中，加入引物27f/1541r模板各2 μL，2×Master Mix 25 μL；PCR反应程序：预变性94 ℃、5 min，变性设1 min，退火55 ℃、1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后72 ℃再延伸5 min，4 ℃冰箱保存。扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，条带单一后，将PCR扩增产物送至通用生物系统(安徽)有限公司进行16S rDNA 的序列分析。测序结果登陆NCBI网站进行同源性分析，采用MEGA 7.0.26软件进行序列对比，并构建系统进化树。

1.2.3 抑菌试验

(1)茶多酚对货架期终点3株优势腐败菌的抑菌作用测定

茶多酚的配置：将100 mg 茶多酚溶解于5 mL 0.15 mmol·L-1H3PO4中，配成浓度为20 mg·mL-1的母液，采用滤膜(0.22 μm)过滤除菌后，保存于为-20 ℃冰箱备用。

抑菌作用测定参照于淑池等[18]的方法。将冷藏珍珠龙胆石斑鱼贮藏货架期终点分离鉴定的3株菌，即苺实假单胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、液化沙雷氏菌接种于LB肉汤培养基，摇床振荡(30 ℃，160 r·min-1)过夜培养活化后，以2%比例接种于LB液体中，继续培养至OD600 nm约为0.5左右，用移液枪吸取菌液100 μL，均匀涂布于LB固体培养基，牛津杯打孔，每孔加入不同浓度(0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg·mL-1)茶多酚溶液50 μL，30 ℃培养箱静置培养24 h，观察3株菌的生长抑制情况，采用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，测量3次取平均值。

(2)最小抑菌浓度(MIC)测定

采用平板涂布法[19]测定MIC，根据抑菌试验结果，将茶多酚母液采用二倍比稀释成6个浓度，苺实假单胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、液化沙雷氏菌测定的浓度选择分别为0.725、1.45、2.9、5.8、11.6 mg·mL-1；0.375、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0 mg·mL-1；0.425、0.85、1.7、3.4、6.8、13.6 mg·mL-1；分别吸取2 mL不同浓度茶多酚溶液于无菌平皿内，再倒入冷却至45 ℃左右的LB琼脂培养基18 mL，冷却凝固后，于平板中均匀涂布100 μL菌液，30 ℃倒置培养24 h，以完全没有菌生长的最低浓度为茶多酚的MIC，每个浓度重复操作3次。

1.3数据处理

实验数据采用Excel处理并作图，利用MEGA 7.0.26软件对菌株16SrDNA序列进行比较，构建系统进化树。

2 结果与分析

2.14 ℃贮藏下珍珠龙胆石斑鱼货架期的确定

2.1.1 贮藏期间感官评分与TVB-N测定结果

由10名训练有素感官评价人员组成评定小组，对4 ℃贮藏下珍珠龙胆石斑鱼进行感官评分；同时测定贮藏期间TVB-N值(用TVB-N表示)的变化，结果见图1。

图1 4 ℃贮藏条件下珍珠龙胆石斑鱼感官评价与挥发性盐基氮测定结果

由图1可知，随着贮藏时间延长，珍珠龙胆石斑鱼的感官评分呈下降趋势。贮藏至第6天时，感官评分为6分，达到临界值，所以选择6 d为珍珠龙胆石斑鱼4 ℃贮藏下的感官可接受终点。

TVB-N指标是指肉类及水产品的蛋白质等含氮物质，在微生物和酶的作用下，分解产生挥发性碱性含氮物质如氨类和胺等的数量[20]，与鲜度有较高的相关性，是评价水产品新鲜度的重要指标，参考鲜海水鱼通则GB/T 18108-2019，TVB-N≤15 mg·100 g-1为一级鲜度；TVB-N≤30 mg·100 g-1为合格品。从图1看出，随着贮藏时间的延长，TVB-N呈不断上升的趋势，第6天为16.8 mg·100 g-1，超过一级鲜度的临界值，第8天为32.2 mg·100 g-1，已超过临界值。以TVB-N为指标判定的鲜度变化情况稍滞后于以感官品质为指标判定的结果。

2.1.2 贮藏期间pH值与菌落总数测定结果

4 ℃贮藏期间石斑鱼鱼肉pH值和菌落总数测定结果见图2。

图2 4 ℃贮藏条件下珍珠龙胆石斑鱼pH值与菌落总数测定结果

一般水产品一级鲜度pH值为6.5～6.8，二级鲜度为6.9～7.0，pH值≥7.1时鱼肉腐败[21]。由图2可知，第0天的pH值为6.6，第4天pH值下降到6.3，第8天pH为7.1，达到腐败临界值。贮藏初期糖原酵解产生乳酸，同时ATP、磷酸肌酸等物质也会分解产生磷酸等酸性物质，使pH值下降；4天以后pH值逐渐上升，是因为蛋白质分解产生碱性物质如挥发性的氨类等引起[15]227,[22]。

Al-Daqal等[23]提出可食用水产品的菌落总数(TVC)上限是6.0 lg(cfu·g-1)；当菌落总数超过上限值，表明鱼肉已经腐败。图2显示，珍珠龙胆石斑鱼菌落总数的变化随贮藏时间的增长逐渐变大，初始值为0.4 lg(cfu·g-1)，第10天达到6.5 lg(cfu·g-1)，以菌落总数为依据判断珍珠龙胆石斑鱼在第8～10天内达到腐败。

综上，感官在第6天达到腐败终点，挥发性盐基氮和pH值在第8天达到临界值，菌落总数在第10天超出水产品可食用的菌落总数上限。以感官评分为确定货架期的主要指标，确定4 ℃贮藏珍珠龙胆石斑鱼的货架期为6 d。

2.2 4℃贮藏珍珠龙胆石斑鱼腐败菌的筛选分离

2.2.1腐败菌的分离纯化

采用平板计数琼脂培养基，从4 ℃珍珠龙胆石斑鱼货架期终点共分离出7株菌，其单菌落特征和革兰氏染色结果见图3。

图3 4 ℃贮藏条件下珍珠龙胆石斑鱼腐败菌的单菌落形态及革兰氏染色结果

图3的菌落特征显示，7株菌均已纯化为特征一致的单菌落；革兰氏染色结果显示，只有P3为革兰氏阳性菌，其余6株菌均为阴性，阴性菌比例为85.7%，说明在货架期终点，革兰氏阴性菌占绝对优势，从形态看，菌株P3为球形，其余为杆形或短杆形。7株菌的相关特征描述及比例统计结果见表1。

表1 货架期终点(6 d)腐败菌的主要特征

由表1可知，7菌株菌落颜色为白色、黄色或淡黄色，除P2边缘不整齐、P3菌落表面干燥、平坦外，其他均为表面光滑，湿润，边缘整齐，隆起；除P3为革兰氏阳性菌外，其他6菌株均为革兰氏阴性菌；除P4接触酶阴性外，其余均为阳性；相同菌落数统计结果显示，P2(21.2%)、P4(28.9%)、P7(35.5%)3菌株占比较高，后续对占比高的3株菌(P2、P4、P7)进行基因序列分析并鉴定。

2.3 珍珠龙胆石斑鱼腐败菌的鉴定及系统进化树的构建

2.3.1 3株菌的16S rDNA基因序列分析

对货架期终点筛选的比例较高的3株(P2、P4、P7)优势腐败菌进行分子鉴定，以优势腐败菌的总 DNA 为模板进行菌落PCR，以1%琼脂糖凝胶电泳检测菌落纯度，电泳结果见图4。

图4 菌株的 16S rDNA 电泳图谱

从图4可见，在 1.5 kb 附近3株菌均出现单一条带，显示PCR 扩增比较成功，可用于后期测序。将PCR 产物送至通用生物系统(安徽)有限公司进行测序，通过 NCBI 软件将测序结果选取同源性最高的菌株序列，采用 MEGA 软件进行多重序列对比，构建系统进化树。菌株种属分析结果见图5、表2。

图5 3株腐败菌的系统进化树构建

表2 3株腐败菌的鉴定结果

从图5、表2可以看出，液化沙雷氏菌(P2)、哈夫尼希瓦氏菌(P4)、苺实假单胞菌(P7)与最大相似菌株的相似度均在98%以上，表明鉴定结果充分可靠。

朱军莉等[24]研究认为，假单胞菌属、希瓦氏菌属、肠杆菌科等腐败菌均是蛋白分解能力强的嗜冷性革兰氏阴性菌，是引起有氧冷藏水产品腐败变质的主要腐败菌；水产品的腐败变质主要是由水环境及捕捞后的外源腐败菌引起，贮藏条件不同，引起水产品腐败变质的腐败菌种也有所不同[25],不同水域的鱼、贝类等水产品在有氧冷藏条件下[26]或冷链流通中[27]的特定腐败菌多为假单胞菌和(或)希瓦氏菌属；其中假单胞菌属会使水产品产生大量小分子醛、酮、酯及有异味的挥发性代谢产物而导致腐败[28]；海水鱼中广泛存在的是希瓦氏菌属[29]，希瓦氏菌产硫能力较强[30]，可以产生大量硫化物，同时能够形成黏附能力较强的生物膜[31]，使其黏附在水产品表面，引起腐败变质；沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)是真空包装和气调包装鱼肉中的优势腐败菌[32]，属于条件致病菌，可以分解肉类蛋白质，或产红色色素，引起肉类及其制品的腐败变质[33]。

2.4 茶多酚抑菌试验结果

茶多酚对液化沙雷氏菌、哈夫尼希瓦氏菌、苺实假单胞菌3株优势腐败菌的抑菌效果见表3。

表3 茶多酚对3株优势腐败菌的抑菌效果

表3显示，茶多酚对3株优势腐败菌均具有较好的抑菌作用，随着茶多酚浓度的增加，抑菌圈直径逐渐增大，相比而言，对苺实假单胞菌的抑制作用最好，液化沙雷氏菌最弱。

根据抑菌作用结果，进一步测定得到茶多酚对苺实假单胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、液化沙雷氏菌的最小抑菌浓度分别为2.9 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、3.4 mg·mL-1。由此可见，茶多酚对3株菌的抑制作用比较接近，相对而言对苺实假单胞菌的抑制作用最强，最小抑菌浓度为2.9 mg·mL-1，对液化沙雷氏菌抑制效果最差，最小抑菌浓度为3.4 mg·mL-1。黄旭镇[11]25采用菌落计数法测定发现，茶多酚对大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌的MIC为0.75 mg·mL-1，孙京新等[34]采用牛津杯法测定茶多酚对假单胞菌的MIC为3.0 mg·mL-1，牛津杯法测定得最小抑菌浓度要比计数法偏高一些[35]，刘五高等[12]46采用平板扩散法测定茶多酚对肺炎克雷伯菌的MIC为1.024 mg·mL-1，可见不同的细菌对茶多酚的敏感性不同，同时MIC的大小也与测定方法有一定关系。

3 结论

根据感官评价、TVB-N、pH值及菌落总数等指标的测定结果，得出4 ℃贮藏下珍珠龙胆石斑鱼货架期是6 d。采用PCA 平板对珍珠龙胆石斑鱼货架期终点的腐败菌进行分离纯化，共分离筛选出7株菌，革兰氏阴性菌占比高达为85.7%；对货架期终点占比较高的3株腐败菌(P2、P4、P7)进行鉴定，进化树分析确定P2为液化沙雷氏菌、P4为哈夫尼希瓦氏菌、P7为苺实假单胞菌；抑菌试验结果表明，茶多酚对液化沙雷氏菌、哈夫尼希瓦氏菌、苺实假单胞菌均具有抑制作用，且抑菌效果具有浓度依赖性，最小抑菌浓度分别为3.4 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、2.9 mg·mL-1。

(责任编辑：李由明)