两种不同胚胎培养基对体外受精/卵胞浆内单精子注射胚胎发育和妊娠结局的影响

李朋粉,窦倩,张乐,张丹,项云改,谭丽

优质胚胎是成功妊娠必不可少的条件之一，因此胚胎体外培养是辅助生殖技术中至关重要的一环。体外培养过程中能量代谢等相关需求对胚胎发育举足轻重，有研究表明胚胎培养过程中所需培养基可能会影响体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF- ET)治疗周期的胚胎质量，进而可能影响临床妊娠率[1-3]。有研究则表明不同培养基对IVF-ET妊娠结局无显著影响[4]。我中心自2018年5月开始逐渐投入使用G-series系列培养基(在此之前使用Quinn’s advantageTM序贯培养基)，发现临床妊娠率有所提高，临床结局的改善与更换培养基有关，还是与临床治疗方案的改进有关，本研究限定了研究人群的年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、降调节方案等，回顾性分析比较本中心使用Quinn’s advantageTM序贯培养基和G-series系列培养基对IVF-ET过程中胚胎发育和妊娠结局的影响，探讨不同培养基是否会影响IVF-ET治疗结局。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2015年1月至2020年9月在郑州大学第二附属医院生殖医学中心进行IVF/ICSI-ET助孕并进行新鲜周期移植患者的临床资料，在此期间我中心使用两种不同的培养基，2015年1月至2018年4月期间使用Quinn’s advantageTM序贯培养基(SAGE公司，美国)，2018年5月后逐渐投入使用G-series系列培养基(Vitrolife公司，瑞典)。只纳入使用单一一种培养基进行胚胎培养的患者资料。

纳入标准：① 女方年龄<35岁；② 采用短效长方案；③ BMI(18.5～24.9)kg/m2；④ 获卵数8～15个；⑤ 移植日内膜厚度≥8 mm；⑥ 仅进行IVF/ICSI受精；⑦ 移植D3卵裂期胚胎，均为优质胚胎，且移植胚胎数不超过2个。

排除标准：① 使用两种培养基的患者；② 供精周期；③ 赠卵周期；④ 子宫畸形、内膜息肉、宫腔积液、粘连、子宫肌瘤、子宫腺肌病者；⑤ 夫妻双方任一方染色体异常者；⑥ 受精失败进行早补救或晚补救ICSI者；⑦ 输卵管造影或阴超显示单侧或双侧输卵管积水者；⑧ 反复种植失败患者；⑨ 高泌乳素血症或合并甲状腺、肾上腺等其他内分泌疾病者。

1.2 方法

1.2.1 分组 按照不同受精方式和培养基进行分组：采用IVF周期分为：Quinn’s组(n=289)和Vitrolife组(n=99)；采用ICSI周期分为：Quinn’s组(n=161)和Vitrolife组(n=60)。

1.2.2 控制性超排卵方案 采用标准长方案进行垂体降调[5]，黄体中期给予促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRh-a，曲普瑞林，德国Ferring公司)进行垂体降调节，达到降调标准后给予促性腺激素(gonadotropin，Gn)，Gn均为尿促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH,丽申宝，上海丽珠制药公司)。根据患者年龄、窦卵泡数、基础FSH、BMI等，启动剂量为150～225 IU/d。促排卵监测过程中参考卵泡大小、血清激素水平调整促排药物剂量。目标卵泡直径达18 mm以上，给予人绒毛膜促性腺激素(human choionic gonadotophin,hCG)10 000 IU进行扳机，36 h取卵。

1.2.3 胚胎培养 取卵当日收集卵子-放射冠-卵丘复合物(oocyte-corona-cumulus complex，OCCCs)，放入卵母细胞培养皿内，置于CO2培养箱培养3～4 h后，卵母细胞进行IVF或ICSI受精[Quinn’s组：Quinn’s AdvantageTMFertilization Medium 1020，加10%人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)；Vitrolife组：G-IVFTMPLUS含10%HSA]，受精后移入卵裂期培养液(Quinn’s组 ：Quinn’s AdvantageTMCleavage Medium 1026，加5%HSA；Vitrolife组 ：G-1TMPLUS含5%HSA)中。受精后第3天除移植和冷冻的胚胎外，剩余胚胎均进行囊胚培养，移入囊胚培养基(Quinn’s组：Quinn’s AdvantageTMBlastocyst Medium 1029，加5%HSA；Vitrolife组 ：G-2TMPLUS含5%HSA)，取卵后第5～6天观察囊胚发育情况。

1.2.4 胚胎评估 胚胎评分参照Peter评分系统[6]，囊胚评分参照Gardner评分系统[7]， D3优质胚胎：来源于2PN，且受精后第3天胚胎细胞数为7～9个，碎片≤10%的胚胎。囊胚形成数：2期及2期以上。优质囊胚：3BB以上的囊胚。总优质胚胎数：2PN来源的D2的4细胞/5细胞，D3的6细胞以上(包含6细胞)的I级、II级胚胎+优质囊胚(3BB以上)。

1.2.5 胚胎移植及临床妊娠评估 取卵后第3天B超引导下进行胚胎移植，移植胚胎数≤2个，均为优质胚胎。移植后30天彩超提示见孕囊者为临床妊娠。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 患者一般临床资料比较

分别比较IVF/ICSI周期中不同培养基患者年龄、BMI、不孕年限、平均获卵数、移植日内膜厚度、D3移植胚胎数，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 患者一般临床资料比较

2.2 同一受精方式下不同培养基对胚胎发育的影响

不论IVF/ICSI周期，Vitrolife组囊胚形成率、总优质胚胎率均高于Quinn’s组，差异有统计学意义(P<0.05)。IVF周期中Vitrolife组D3优质胚胎率高于Quinn’s组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组2PN受精率、2PN卵裂率相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 不同培养基对胚胎发育的影响[%(例)]

2.3 同一受精方式下不同培养基对临床结局的影响

不论IVF/ICSI周期，Vitrolife组临床妊娠率均高于Quinn’s组，差异有统计学意义(P<0.05)。ICSI周期中，Vitrolife组胚胎植入率高于Quinn’s组，差异有统计学意义(P<0.05)。而IVF周期中，与Quinn’s组相比，Vitrolife组胚胎植入率有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。两组早期流产率、异位妊娠率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 不同培养基对临床结局的影响[%(例)]

2.4 Logistic回归分析

将潜在混杂因素如女方年龄、BMI、不孕年限、获卵数、移植日内膜厚度、D3移植胚胎数、受精方式、不同培养基纳入Logistic回归，以是否临床妊娠为因变量进行分析。结果显示：不同培养基(OR=0.539,95%CI0.363-0.801，P=0.002)和移植胚胎数(OR=4.784,95%CI1.715-13.349，P=0.003)是影响临床妊娠的因素，详见表4。

表4 Logistic回归分析结果

3 讨论

目前关于培养基是否影响IVF-ET治疗结局尚有争议，有研究数据表明培养基可能会影响胚胎发育、IVF-ET妊娠结局，甚至对新生儿健康造成影响[1,8-9]，这可能与不同培养基中的成分不同有关。Tarahomi M等[10]纳入了15种用于IVF实验室的商品化培养基(包括Vitrolife和Quinn’s培养基)，比较分析不同培养基中葡萄糖、乳酸、丙氨酸、21种氨基酸等37种成分的浓度，发现不同培养基之间的组成不同，没有两种培养基具有相同的成分浓度。

本中心自2018年5月投入使用G-series系列培养基后临床妊娠率有所提高。为探讨是由于更换培养基还是临床方案的改进造成妊娠结局改善，限定了纳入研究人群，回顾性分析比较Quinn’s advantageTM序贯培养基和G-series系列培养基对胚胎发育和IVF-ET妊娠结局的影响。结果表明与Quinn’s advantageTM序贯培养基相比，使用G-series系列培养基进行体外培养，得到的优质胚胎更多，临床妊娠率也明显提高，推测胚胎发育和临床结局的改善可能与两种培养基中所含有的成分不同或成分含量不同有关。

胚胎发育早期阶段对能量代谢需求低，主要依靠三羧酸循环和磷酸化氧化产生能量，以乳酸、丙酮酸、谷氨酰胺为底物[11-12]，胚胎发育至桑椹胚期对葡萄糖需求增加[13]。Chu D等[14]在受精延迟6 h小鼠胚胎中添加5 mM葡萄糖可改善胚胎发育潜力。Gardner DK等[15]研究结果表明在最终形成囊胚的胚胎中，形成评分高的囊胚，葡萄糖的摄入量最大，提示葡萄糖是囊胚发育所需的更为重要的营养。此外，氨基酸在配子发生、受精、胚胎着床、胎盘植入、胎儿生长发育过程中起着至关重要的作用[16]。其中，丙氨酸和谷氨酰胺摄取可能与囊胚发育有关[11]。谷氨酰胺是植入前胚胎所需的重要非必需氨基酸，在体外发育过程中，约70%谷氨酰胺参与三羧酸循环，为植入前胚胎发育提供能量底物，还参与谷氨酸和α-戊酮二酸的合成，同时具有抗氧化作用、能够清除自由基，有益于哺乳动物早期胚胎的生长发育[17]。Devreker F等[18]将138个正常受精胚胎随机分配到含有或没有1 mm谷氨酰胺的无葡萄糖培养基中，含有谷氨酰胺培养的胚胎达到桑葚期和囊胚期比例高于不含谷氨酰胺的，提示向培养基中添加谷氨酰胺有利于植入前胚胎发育，增加了发育到桑葚期和囊胚期胚胎的比例。

本研究结果显示：与Quinn’s组相比，Vitrolife组囊胚形成率、总优质胚胎率均显著性升高。推测这可能与Vitrolife培养基中葡萄糖、乳酸含量均高于Quinn’s 培养基[葡萄糖：卵裂期(0.5±0)mmoL vs 0、囊胚期(3.28±0.03)mmoL vs (2.27±0.03)mmoL；乳酸：卵裂期(10.7±0.1)mmoL vs (4.3±0)mmoL、囊胚期(6.02±0.01)mmoL vs (4.16±0.06)mmoL]，以及Vitrolife培养基中含有丙氨酸和谷氨酰胺，而Quinn’s 培养基中丙氨酸含量低于检测极限(<1 μmol/L)，且未检测到谷氨酰胺有关[10]。

本研究结果提示G-series系列培养基比Quinn’s advantageTM序贯培养基可能更有利于胚胎的发育，能够提高临床妊娠率，为辅助生殖中心选用商品化培养基提供一个参考。为了减少影响妊娠结局的混杂因素，本研究纳入35岁以下、获卵数8～15个的卵巢正常反应的患者，采用黄体期降调节方案，这样比较两种培养基的差别有一定的参考价值。但纳入人群可能存在局限性，后续会比较不同培养液对不同用药方案、不同年龄、不同卵巢反应患者的胚胎发育情况，期望有大样本前瞻性的研究为临床提供更有利于胚胎发育的商品化培养液。