水提法和醇提法对舒肝和络醒脾方抗肝纤维化作用的影响*

张秋菊，王奎淞，孙墨晗，李婕妠，郭嘉琪，刘 靓，刘 静，赵鲲鹏

(甘肃中医药大学， 甘肃 兰州 730000)

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是由各种原因引起的慢性肝损伤后，肝脏正常结构被破坏而致的肝细胞外基质的异常积聚。目前尚无疗效确切的抗HF药物，复方中药因其多靶点、多途径的作用特点在HF的防治上有着独特的优势。肝纤维化属中医学“积聚”“癥积”“臌胀”范畴。综合历代医家的认识，在气血的关系上，慢性肝病的发生发展符合叶天士“初病在经在气，久病入血入络”的病机演变推论。甘肃中医药大学国家级名老中医周信有教授基于多年临床经验和久病入络理论，总结出了治疗慢性肝病的舒肝化癥方，而舒肝和络醒脾方是在其基础上凝练而来，由醋柴胡、岷当归、炙黄芪、莪术、鳖甲、枳椇子6味药组成。临床上，复方中药多以水提法和醇提法提取后服用。水提法和醇提法是中药提取最常用的两种方法，分别代表了传统水煎用药和现代制剂工艺[1-3]。舒肝和络醒脾方的水提物和醇提对肝纤维的治疗是否有差异目前尚不明确。本实验通过观察水提和醇提两种不同提取物对四氯化碳(CCL4)肝纤维化模型大鼠的作用，探讨舒肝和络醒脾方水提和醇提方式对其抗纤维化疗效的影响。

1 材料与方法

1.1 动 物

无特定病原体(SPF)级Wistar大鼠40只，体质量(200±20) g，雌雄各半，购自甘肃中医药大学动物实验中心并饲养于此，动物生产许可证号为SCXK(甘)2015-0002，动物使用许可证号为SYXK(甘)2015-0005。

1.2 药物、试剂与仪器

舒肝和络醒脾方处方：醋柴胡10 g，岷当归15 g，炙黄芪12 g，莪术12 g，鳖甲10 g，枳椇子10 g。药材购自甘肃中医药大学附属医院药剂科，并经甘肃中医药大学中药鉴定教研室鉴定。舒肝和络醒脾方水提法按临床用药比例取单味药物混合，加5倍量水，不浸泡，回流提取0.5 h，趁热过滤；药渣再加4倍水回流提取0.5 h，趁热过滤；合并滤液；浓缩，使生药含量为 2 g/L。醇提法按方取单味药物混合浸泡，加10倍量体积分数为 700 mL/L乙醇，不浸泡，回流提取1.5 h，趁热过滤；药渣再加8倍量 700 mL/L 乙醇煎煮1.5 h，趁热过滤；合并滤液；浓缩，使生药含量为2 g/L。秋水仙碱片，西双版纳药业有限责任公司产品，产品批号180101，0.5 mg/片。用研钵将秋水仙碱片磨碎，以生理盐水溶解，使其质量分数为 0.1 g/L。食用橄榄油，山东鲁花集团有限公司产品，产品批号为GB/T23347；CCl4分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司产品，产品批号20120211；透明质酸酶(HA)和IV型胶原(CIV)酶联免疫吸附试剂盒，均为江苏菲亚生物科技有限公司产品，产品批号依次为MM-0853R1、MM-0296R1；Masson三色染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司产品，产品批号G1340；Infinite M200 Pro酶标仪，奥地利TECAN公司产品；TC6010L全自动生化分析仪，江西特康科技有限公司产品；ASP200S全自动组织脱水机和RM2235型切片机，均为德国Leica公司产品；BX51M显微镜及图像采集系统，日本OLYMPUS株式会产品。

1.3 分组与造模

将40只大鼠分为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组、疏肝活络醒脾方水提组和疏肝活络醒脾方醇提组5组，每组8只。适应性喂养1周后开始实验。造模开始第1天，除正常对照组外，其余各组大鼠均腹腔注射体积分数为400 mL /L 的CCl4橄榄油溶液，注射剂量2.0 μL/g体质量，每周3次，至第8周末[4-7]。

1.4 给药方法

从造模第2天开始给药，1 d 1次至第8周末。参考《实验药理方法学》[8]按体表面积换算大鼠灌胃剂量。舒肝和络醒脾方水提组和醇提组分别给予水提物和醇提物，以4倍等效剂量28.75 g/kg体质量灌胃；秋水仙碱组用秋水仙碱溶液5.0 μL/g体质量灌胃；模型对照组以等量生理盐水灌胃；正常对照组不做任何处理。各组均正常喂食喂水。

1.5 检测指标

1.5.1 取 材

于第8周末当晚，大鼠禁食不禁水12 h，次日上午称量体质量后，用20 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剥离腹主动脉，以真空采血管腹主动脉取血，静置 2 h，离心，取血清，-80 ℃保存备用。取肝脏，以4 ℃生理盐水冲洗，去除薄膜和残留组织，称量质量；取肝脏中叶，于肝右叶离边缘1 cm处切取大小为1 cm×1 cm×0.1 cm的肝组织，以质量分数为40 g/L的甲醛固定。

1.5.2 肝指数

肝指数(%)=肝质量(g)/体质量(g)×100%[9-11]。

1.5.3 肝纤维化血清学指标

取大鼠血清，采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清HA、CIV水平。

1.5.4 肝脏功能血清学指标

采用全自动生化仪以赖氏法检测各组血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的含量。

1.5.5 肝脏结构观察及纤维化程度评估

甲醛固定的肝脏组织经脱水、包埋、切片后，以Masson染色，光镜下每张切片选取10个不同视野，观察肝小叶结构、纤维间隔、炎细胞浸润等情况，对肝纤维化程度进行评估。切片用双盲法由3位病理医师评估。肝纤维化分期参照2002年肝纤维化诊断评估标准[12-13]。0期：无纤维化。1期：汇管区纤维化扩大，局限于窦周和小叶内纤维化。2期汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留。3期：纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化。4期：早期肝硬化。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠肝指数对比

与正常对照组对比，模型对照组肝指数升高，3个药物组的肝指数均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。舒肝和络醒脾方水提组与醇提组的肝指数对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肝指数对比

2.2 各组大鼠血清HA、CIV水平对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠血清中HA、CIV水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，3个药物组大鼠血清HA、CIV均下降(P<0.05)。与秋水仙碱组对比，舒肝和络醒脾方水提组大鼠血清HA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而水提组的CIV及醇提组的HA、CIV水平降低，差异均无统计学意义(P>0.05)。舒肝和络醒脾方水提和醇提组两组间对比，血清HA水平差异有统计学意义(P<0.05)，而血清CIV水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠HA、CIV水平对比

2.3 各组大鼠ALT、AST水平对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠血清ALT、AST水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，3个药物组大鼠血清ALT、AST水平均降低(P<0.05)。3个药物组之间的两指标对比，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠ALT、AST水平对比

2.4 各组大鼠肝纤维化程度对比

Masson染色后增生的胶原纤维呈现亮蓝色。光镜下，正常对照组大鼠肝脏小叶轮廓清晰，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状排列，窦周和小叶内未见纤维间隔。模型对照组大鼠肝脏结构紊乱，窦周和小叶内可见明显纤维间隔形成，纤维间隔分割肝小叶，肝细胞脂肪变、坏死明显。3个药物组大鼠肝脏小叶结构逐渐恢复，纤维分割明显减少，肝细胞脂肪变、坏死减轻，舒肝和络醒脾方水提组和醇提组尤为明显。见图1。

A.正常对照组:肝脏结构正常，肝小叶轮廓清晰，肝索围绕中央静脉呈放射状排列。B.模型对照组：肝脏结构紊乱，纤维间隔分割肝小叶，肝细胞脂肪变、坏死明显。C.秋水仙碱组：肝脏结构紊乱减轻，分割肝小叶的纤维间隔减少，肝细胞脂肪变、坏死减轻。D.舒肝和络醒脾方水提组：肝脏结构紊乱明显减轻，纤维间隔基本消失。E.疏肝和络醒脾方醇提组：肝脏结构紊乱有所减轻，偶见纤维间隔。黑色箭头所示为纤维间隔。

根据Masson染色结果，参照2002年肝纤维化诊断评估标准，对肝纤维化程度进行量化，结果显示：与正常对照组对比，模型对照组大鼠肝脏纤维化程度加重，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，3个药物组大鼠肝脏纤维化程度均减轻(P<0.05)。舒肝和络醒脾方水提和醇提组大鼠肝脏纤维化程度对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠肝纤维化程度对比 只

3 讨 论

实验研究发现，舒肝和络醒脾方具有明显的改善肝纤维化的功效[14-17]。本实验分别采用水提法和醇提法提取舒肝和络醒脾方的有效成分，观察其对CCl4所致HF模型大鼠肝脏形态和功能的影响，对两种提取物的抗肝纤维化功效进行了比较。中药水提法即传统煎煮法，指利用水的溶解性将中草药中亲水性的有效成分溶解出来，因其符合中医传统用药习惯，制备方法简单易行，是中药提取中应用最早也是至今应用最为广泛的方法；但由于其提取成分复杂、杂质多、有效成分损失多(尤其是脂溶性成分)等缺点，为中药精制带来了一定困难。醇提法多指利用乙醇的溶解性，将乙醇作为溶剂对物质进行分离提纯的方法。乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强，弥补了水提法的一些不足之处[18-19]。

肝指数是衡量肝脏大小的指标，血清HA和CIV是评估肝纤维化程度最为敏感的血清学指标，血清ALT、AST水平是评估肝脏功能的常用指标，肝脏的HE和Masson染色是从形态学角度对肝纤维化程度进行评估。本实验结果显示：肝指数、血清学指标HA、CIV、ALT、AST含量及肝纤维化程度方面，与模型对照组对比，舒肝和络醒脾方水提组和醇提组差异均有统计学意义(P<0.05)。而水提组与醇提组之间对比，虽然HA、ALT和AST差异有统计学意义(P<0.05),但数值向反方向背离(如水提组降低AST的效果不及醇提组，但醇提组降低ALT的效果不及水提组)，因此，此数据无法证明两组间治疗效果的差异。结果表明：舒肝和络醒脾方水提物和醇提物对肝纤维化均有明显疗效，不同提取方法对其疗效无明显影响。

水提法和醇提法对舒肝和络醒脾方疗效无明显影响，但是其有效成分目前仍未明确，治疗肝纤维化的机制还处于探索阶段，因此，还需进一步深入研究以明确其有效成分及作用机制[20]。