钠-葡萄糖共转运蛋白-2抑制剂对2型糖尿病大鼠心功能的保护作用及其机制研究

冷燕，张爱宁，张丽琼，吴洋，李维，熊永红，李文远，季烨龙，夏中元

1.武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060；2.华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院(武汉市妇幼保健院)手术室，湖北 武汉 430016

2 型糖尿病是心血管疾病的独立危险因素，糖尿病心肌中多种细胞机制的失调增加了心衰的风险，包括异常的自噬、氧化应激失衡和晚期糖基化产物的积累等[1]。多种针对失调的细胞机制和病理生理途径的药物干预可降低心衰的风险，但优化的血糖控制与2型糖尿病患者心血管功能改善的关系最为密切[2]。钠-葡萄糖共转运蛋白-2(glucose transporters 2，SGLT2)位于肾脏近端小管的S1～2 段，能重吸收约90%的葡萄糖，而SGLT2 抑制剂(SGLT-2i)通过抑制肾脏近端小管对钠和葡萄糖的重吸收而降低血糖[3]。近年来SGLT-2i的心血管系统保护作用成为新的研究热点。一项针对亚太、中东和北美2 型糖尿病患者的大型临床研究发现，启动SGLT-2i 治疗与较低的心血管事件风险相关[4]。研究推测，SGLT2抑制剂可能通过促排钠、降血压、胰岛素增敏等途径发挥心血管保护作用，但其确切机制目前仍未明确[3]。糖尿病引起的心脏功能异常伴随着自噬的损害，研究证实雷帕霉素能够通过抑制其靶蛋白增加自噬缓解糖尿病心肌病、改善心功能[5]。然而2 型糖尿病代谢组学提示，SGLT2i 可改善肾脏功能，可能与提高肾小管自噬水平相关[6]。SGLT2i 是否可通过诱导保护性自噬从而改善糖尿病大鼠心功能尚待进一步研究。本研究拟探讨SGLT2i 对2 型糖尿病大鼠心功能和自噬水平的影响及其机制，为2 型糖尿病心血管并发症的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 选取成年雄性大鼠40只，体质量220～230 g，由北京华阜康生物公司提供。实验动物适应性饲养1周后，采用随机数表法将大鼠分为对照组(Ctrl 组)、糖尿病组(Dia 组)、糖尿病+达格列净组(Dia+Dap组)和糖尿病组+达格列净+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(Dia+Dap+3-MA 组)，每组8 只。2 型糖尿病大鼠造模成功后，继续高脂高糖饲料饲养4周，Dia+Dap 组每日灌胃给予达格列净[0.1 mg/(kg·d)]，Dia+Dap+3-MA组大鼠尾静脉注射3-MA[15mg/(kg·周)]。非药物灌胃或尾静脉注射的大鼠，灌胃或尾静脉注射同等体积的生理盐水。本研究通过实验动物福利伦理审查。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的制备 大鼠适应性饲养1 周后，高脂高糖饲料喂养4 周。禁食12 h 后腹腔注射柠檬酸盐-链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，美国)30 mg/kg，对照组给予等剂量柠檬酸盐缓冲液进行尾静脉注射。3 d 后尾静脉采血，空腹血糖≥11.1 mmol/L，并出现多饮、多食、多尿的典型糖尿病症状，则认为2型糖尿病大鼠模型制备成功，剔除不成模大鼠。继续高脂高糖饲料喂养4 周，所有糖尿病大鼠自由饮水及进食，各组大鼠均饲养在温度和湿度恒定的SPF级动物中心。

1.3 大鼠空腹血糖浓度和胰岛素抵抗水平 检测大鼠腹腔注射STZ后48 h，禁食12 h取尾静脉血，血糖仪检测空腹血糖浓度(fasting blood glucose，FBG)，采用酶联免疫法(ELISA)检测各组大鼠血清胰岛素(insulin，INS)水平，稳态模式评估法计算胰岛素抵抗指数(HOME-IR)，计算公式如下：HOMA-IR=INS(IU/L)×FBG(mmol/L)/22.5。

1.4 心功能指标测定 2型糖尿病大鼠造模成功4周后，大鼠面罩吸入异氟烷(2%～4%)诱导麻醉。固定大鼠于左侧卧位，接心电监护，采用频率为15 MHz的超声探头和GE Vixid7型超声(ATL公司，美国)检测大鼠心功能。将探头置于大鼠胸骨的左缘，与正中线成30°角，显示大鼠胸骨左室长轴切面。探头顺时针旋转90°，调整显示大鼠左室的短轴切面。测量大鼠左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)。M型检测左室射血分数(LVEF)。根据二尖瓣口流速频谱，测量舒张早期心室充盈速度最大值(E)、舒张晚期心室充盈速度最大值(A)，计算峰值流速比值(E/A比值)。

1.5 Western blot 法测定心肌组织LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62 和Becline 1 的表达水平 心功能测定结束后，立即处死大鼠，取新鲜心肌组织，加入预冷的RIPA液裂解心肌组织充分匀浆，低温离心15 min(2 000 r/min，离心半径8.6 cm)取上清。Bicinchoninic acid(BCA)法测蛋白浓度，调整蛋白浓度后加入5×SDS 上样缓冲液，100℃加热5 min。采用SDS-PAGE 电泳分离和转膜后，加入p62、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Becline 1和GAPDH一抗4℃摇床孵育12 h (1：1 000，CST 公司，美国)，GAPDH为内参。TBST一抗洗脱后，室温下荧光二抗避光孵育1 h(1：10 000，Millpore 公司，美国)，红外成像系统(Li-Cor 公司，美国)成像，Odessay 软件测量各条带灰度值(Li-Cor公司，美国)，计算LC3Ⅱ/Ⅰ灰度值比值，p62 和Becline 1 的蛋白表达水平采用目的蛋白灰度值/内参GAPDH的比值表示。

1.6 统计学方法 应用SPSS22.0 软件进行数据统计学分析，计量资料以均值±标准差()表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的FBG、INS 和HOMA-IR 指数比较 饲养过程中，观察发现，对照组大鼠毛发光泽，反应灵敏，而糖尿病组大鼠出现了典型的多饮、多食和多尿的症状，同时毛发干枯发黄，活动减少。与Ctrl组注射前比较，高脂高糖饲养四周后，大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数升高，差异有统计学意义(P<0.05)。高脂高糖饲养组腹腔注射STZ 后1周，大鼠空腹血糖水平和胰岛素抵抗指数较注射前显著增高，而血清胰岛素水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。Ctrl组腹腔注射生理盐水后1周，大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数较注射前变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清中FBG和INS水平及HOMA-IR指数比较()

表1 各组大鼠血清中FBG和INS水平及HOMA-IR指数比较()

2.2 各组大鼠的心功能各项指标比较 经胸心脏超声结果显示，与Ctrl 组比较，Dia 组LVEDV、LVEF、HR、E峰流速和E/A比值降低，A峰流速升高，差异有统计学意义(P<0.05)，LVESV 差异无统计学意义(P>0.05)。与Dia组比较，Dia+Dap组LVEDV、LVEF、HR、E峰流速和E/A比值升高，A峰流速降低，差异有统计学意义(P<0.05)，LVESV差异无统计学意义(P>0.05)。与Dia+Dap组比较，合并给予自噬抑制剂3-MA的糖尿病大鼠中，LVEDV、LVEF、HR和E/A比值降低，A峰流速升高，差异有统计学意义(P<0.05)，E 峰流速和LVESV差异无统计学意义(P>0.05)，见图1和表2。

图1 各组大鼠心脏超声图

表2 各组大鼠的心功能各指标比较()

表2 各组大鼠的心功能各指标比较()

2.3 各组大鼠的心功能及自噬相关蛋白表达水平比较 免疫印迹结果显示，与Ctrl 组比较，Dia 组LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低，Becline1 表达降低，而p62 的表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与Dia 组比较，Dia+Dap 组LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高，Becline1 表达升高，而p62 的表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与Dia+Dap 组比较，合并给予自噬抑制剂3-MA 的糖尿病大鼠中，LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低，Becline1表达降低，而p62的表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2和表3。

图2 各组大鼠心脏组织蛋白表达水平

表3 各组大鼠LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的蛋白表达水平比较()

表3 各组大鼠LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的蛋白表达水平比较()

注：与Ctrl组比较，aP<0.05；与Dia组比较，bP<0.05；与Dia+Dap组比较，cP<0.05。

3 讨论

本研究参照文献[7]，采用高糖高脂饲养4 周后，腹腔注射小剂量链脲佐菌素的方法制备2型糖尿病大鼠模型。STZ 腹腔注射一周后，糖尿病大鼠空腹胰岛素水平显著降低而胰岛素抵抗指数显著增高，提示大鼠的胰岛素敏感性降低，2 型糖尿病大鼠造模成功。同其他研究报道一致，饲养8周后，心脏超声结果显示糖尿病组大鼠左心室射血分数和E/A峰流速比值较对照组显著降低，这表明2 型糖尿病大鼠已出现典型的糖尿病心脏收缩和舒张功能不全[8-9]。急性心血管事件是2型糖尿病患者的主要死因[10]，因此探寻2型糖尿病心血管保护措施是相关学科的研究重点。近年来2型糖尿病的药物研究重心逐渐从传统致病机制的研究转移到新的治疗靶点和发病机制的研究。钠-葡萄糖转运蛋白2 位于肾近曲小管，抑制其功能可减少葡萄糖的重吸收，增加尿糖排泄，从而发挥降糖作用[11]。钠-葡萄糖共转运蛋白2 抑制剂是一类新型的口服降糖药物，美国糖尿病学会和欧洲糖尿病学会(ADA/EASD)指南推荐SGLT2i 可单独或与其他降糖药物联合用于2型糖尿病患者的治疗[12]。针对多项大型随机化临床试验的系统评价结果表明，SGLT2i降低了糖尿病患者23%的心血管相关死亡或因心力衰竭住院的风险，合并或不合并动脉粥样硬化性心血管疾病和心力衰竭史的糖尿病患者也能从SGLT2i治疗中获益[13]。达格列净是临床常用的SGLT2i，本研究通过建立稳定的2型糖尿病大鼠心脏损伤模型，证实给予临床剂量的达格列净提高糖尿病大鼠左心室LVEF 和E/A 比值，这一结果明确了SGLT2i 对2 型糖尿病大鼠心脏舒张和收缩功能的改善作用。

新近研究发现，SGLT2i能够减轻糖尿病大鼠的心脏纤维化程度，改善血流动力学，同时能够有效地降低心肌缺血再灌注后的梗死面积，这一保护作用可能与SGLT2i维持线粒体池的稳定性相关，但具体机制尚待进一步研究证实[14-15]。自噬是细胞代谢过程中保守且必要的机制，基础水平的自噬对于保护心肌细胞免受持续性高血糖的损伤至关重要，然而糖尿病心肌自噬水平显著降低，研究证实提高自噬水平有助于延缓糖尿病心肌病的发生发展[16]。值得注意的是，本研究中SGLT2i 改善糖尿病大鼠心脏舒张和收缩功能的同时，伴随着自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值的升高。为了进一步证实SGLT2i 是否通过激活自噬改善糖尿病大鼠心功能，在给予达格列净糖尿病大鼠中合并给予自噬抑制剂3-MA，结果显示，在静脉给予3-MA的大鼠中，SGLT2i 的心脏保护作用消失，同时3-MA 组中的心肌自噬水平较达格列净组显著降低。

综上所述，SGLT2i 可改善糖尿病大鼠心脏功能，其机制与提高糖尿病大鼠心肌的自噬水平相关。