青麦仁麸皮中阿魏酸的抗氧化性和抑菌活性研究

张康逸 ，杨徐宁 ，，许国震 ，温青玉 ，王志伟 ，张国治

（1.河南省农业科学院农副产品加工研究中心，郑州 450002；2.河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001；3.濮阳市农业科学院，河南濮阳 457000；4.濮阳县农业农村局，河南濮阳 457100）

0 引言

食品安全和食品质量影响着消费者的身体健康及日常生活状态，在现代化社会的快速进程中，对食品安全和食品质量的研究显得尤为重要［1-2］。食品中的腐败菌是直接或间接影响食品质量及消费者健康的一类微生物。食品腐败菌附着在食品表面并吸食着食品中的营养物质导致食品质量下降，甚至有些还产生毒素，危及消费者身体健康［3-5］。

近年来，研究人员对阿魏酸（FA）的抗氧化能力和抑菌性进行初探，郭丽等［6］对玉米皮提取液中阿魏酸清除自由基的能力进行测定，试验结果显示阿魏酸对羟基、超氧阴离子、DPPH 3种自由基均有较强的清除效果；食品行业的抑菌性测定具有确定食品货架期和天然功能性物质抗菌能力等作用，包含对细菌、霉菌及酵母的抑菌效果测定［7-11］。李堆淑［12］选取 3 种细菌对绿茶茶多酚提取物进行抑菌能力测定，结果显示浓度为1×10-2mg/mL的绿茶茶多酚对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌效果较显著，抑菌率分别为45.77%和46.01%，而对金黄色葡萄球菌抑制效果不显著。

鲜食谷物—青麦仁具有较高的营养价值，其麸皮中含有多种活性物质如黄酮类、酚酸类、类胡萝卜素和叶绿素等［13］。阿魏酸是青麦仁麸皮中酚酸类的一种，因其多种生理活性而被应用于日化、农业及药品行业。随着人们对青麦仁的优势了解的越来越多，对阿魏酸功能性的认识也越来越深刻。对青麦仁麸皮中天然阿魏酸的抗氧化和抑菌活性的研究，一方面帮助人们逐步认识及了解阿魏酸的性质；另一方面，扩大阿魏酸的应用范围，同时满足消费者对于天然阿魏酸的需求，实现青麦仁较高的营养价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

92.57%（w/w）青麦麸阿魏酸（烟台市双双化工有限公司）；2，2-联氮双（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）标准品、2，4，6-三吡啶基 -S-三嗪（TPTZ）、丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）和维生素C（VC），均购于北京索莱宝科技有限公司；乳酸链球菌素（食品级，上海元泰生物工程有限公司）；脱氢乙酸钠（食品级，山东优索化工有限公司）；牛津杯（内径6 mm，外径8 mm）；黑曲霉（Aspergillus niger），灰绿青霉（Penicilliun glaucum），大肠杆菌（Escherichia coil），金黄色葡萄球菌（Staphylococus aureus），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），以上菌株均由湖北省工业微生物菌种保藏和研究中心提供；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-3C型数显酸度计（杭州雷磁分析仪器厂）；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司）；A590型紫外可见分光光度计（上海翱艺仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯医疗生物仪器有限公司）；FA2004N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）；HNY-2102C型恒温培养震荡器（天津市欧诺仪器仪表有限公司）；SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博讯医疗生物仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 青麦麸阿魏酸的制备过程

对青麦麸进行去淀粉、去蛋白、去色素处理后，冷冻干燥。称取一定量预处理后的青麦麸、1%的氢氧化钠溶液、0.2 g/L的亚硫酸钠和95%的乙醇置于烧杯中，在料液比为1：15和提取温度为80 ℃的条件下提取2 h，降温后经4 000 r/min离心作用10 min，收集上清液冷冻干燥后备用。

1.3.2 青麦麸阿魏酸体外抗氧化性的测定

1.3.2.1 青麦麸阿魏酸总抗氧化活性的测定

采用铁离子还原能力法评估青麦麸阿魏酸的总抗氧化活性。

1.3.2.2 阿魏酸对DPPH自由基清除能力测定

参照文献［3］中DPPH自由基清除率的测定方法，以无水乙醇为空白溶液，BHT、BHA、VC作为对照物。

1.3.2.3 阿魏酸对羟基自由基清除能力测定

参照文献［14］中羟基自由基清除率的测定方法，以去离子水为空白溶液，BHT、BHA、VC作为对照物。

1.3.2.4 阿魏酸对ABTS自由基清除能力测定

参照文献［15］中ABTS自由基清除率的测定方法，以无水乙醇为空白溶液，BHA、BHT和VC作为对照物。

1.3.3 青麦麸阿魏酸的抑菌性试验

1.3.3.1 试验菌种的活化

将冷冻保藏的黑曲霉、灰绿青霉置于4 ℃冰箱中解冻，取出2株菌株接种于孟加拉红固体培养基和PDA固体培养基上，在28 ℃条件下培养2～7 d进行活化。

吸取少许LB-Broth液体培养基与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌冻干菌株混合均匀，随后吸出管内3株菌株菌液划线接种于LBBroth固体培养基，放置于恒温培养箱中。将具有繁殖能力的3株细菌单菌接种到LB-Broth液体培养基中，放置37 ℃、115 r/min恒温震荡培养24 h。

1.3.3.2 试探性预试验

为了试探阿魏酸对供试菌有无抑制作用，对于霉菌，采用FA冻干粉作用于已接种供试菌的PDA培养基上，28 ℃恒温培养5 d左右后观察；对于细菌，采用FA冻干粉作用于涂满供试初始菌液的LB-Broth固体培养基上，37 ℃恒温培养24 h后观察。

1.3.3.3 试验菌株菌悬液的制备

通过分光光度法结合平板菌落计数法，将初始菌液配制成活菌浓度为106CFU/mL备用，并称为试验菌株。

用无菌水将初始菌液稀释成10-6、10-7、10-8、10-9、10-10五个不同浓度梯度的细菌菌液，取1～2 mL不同浓度稀释液于试管中，以LBBroth液体培养基为空白，在600 nm处测定其光密度值；另取不同浓度稀释液各0.2 mL均匀涂布于LB-Broth固体培养平板上，36 ℃培养22 h后，以平板上单菌落个数在20～100个为计数培养皿，记录不同浓度菌液培养皿上的菌落数量，活菌浓度计算见下式：

式中C—— 某稀释倍数下的活菌浓度，CFU/mL；

C0——某稀释倍数下的单菌落总数；

V—— 固体培养皿上某稀释倍数下的菌液体积，mL；

k——稀释倍数。

1.3.3.4 敏感性的测定

将阿魏酸分别配制成浓度为62.5，125，250，500，1 000 mg/mL梯度溶液，以BHT、BHA和VC作为对照品，汲取106CFU/ mL菌液0.2 mL于固体培养表面，涂布致使菌株均匀附着。在培养皿中均匀放置4个内径为6 mm的牛津杯，每个牛津杯中分别加入 62.5，125，250，500，1 000 mg/mL梯度的10 µL FA以及对照品，37 ℃恒温培养22 h后，取出并测定抑菌圈的大小。以上试验均进行3次平行试验。

1.3.3.5 最低抑菌浓度（MIC）的测定

对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，通过琼脂平板稀释法制成阿魏酸浓度为100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39 mg/mL 一系列梯度的LB-Broth琼脂培养基；对于枯草芽孢杆菌，以50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39，0.20 mg/mL 的FA浓度的LB-Broth琼脂培养基进行试验，维生素C、乳酸链球菌素和脱氢乙酸钠为试验对照品。

取100 µL 3种试验菌种（106CFU/ mL）接种于含有不同浓度的FA和对照品的LB-Broth琼脂培养基上，均匀涂布后倒置，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，取在LB-Broth琼脂培养基上无菌落形成的FA、维生素C、乳酸链球菌素和脱氢乙酸钠的最低浓度为4者对食品腐败菌的最低抑菌浓度。以上试验进行3次平行试验［16］。

1.3.3.6 不同pH值对最低抑菌浓度的影响

分别将LB-Broth琼脂培养基的pH值调至2，3，4，5，6，7，8，9，10，随后按照1.3.3.5 将25，18.75，12.5，6.25，3.13，2.1，1.56 mg/mL 的 FA 浓度LB-Broth琼脂培养基进行试验，测定不同pH值对FA最低抑菌浓度的变化情况及影响。以上试验进行3次平行试验。

1.3.3.7 最低杀菌浓度（MBC）的测定

对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，通过液体培养稀释法制成含有阿魏酸浓度为 400，200，100，50，25，12.5，6.25 mg/mL一系列梯度的LB-Broth液体培养基，以维生素C、乳酸链球菌素和脱氢乙酸钠为试验对照品进行试验。以上试验进行3次平行试验。

取100 µL 3种试验菌种（106CFU/mL）接种于含有不同浓度的FA和对照品的LB-Broth液体培养基中，放置在37 ℃恒温摇床中震荡3 h后，取出100 µL锥形瓶中菌液，均匀涂布于LBBroth琼脂培养基后倒置，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，通过观察，LB-Broth琼脂培养基上无菌落形成的FA、维生素C、乳酸链球菌素和脱氢乙酸钠的最低浓度即为4者对食品腐败菌的最低杀菌浓度。以上试验进行3次平行试验。

2 结果与分析

2.1 阿魏酸体外抗氧化性的测定结果与分析

2.1.1 阿魏酸总抗氧化活性的测定结果与分析

阿魏酸的铁离子还原能力可按标准曲线换算成FeSO4当量浓度来反映。对不同质量浓度的FA的总抗氧化能力进行测定，结果如图1所示，随着FA的质量浓度升高，其铁离子还原能力逐渐增大，当FA的质量浓度在0.6 µg/mL时，其铁离子还原能力与0.92 mmol/L的FeSO4相当；当FA的质量浓度为0.6～0.9 µg/mL时，其铁离子还原能力与0.92～2.04 mmol/L的FeSO4相当；当FA的质量浓度为0.9～1.0 µg/mL时，其铁离子还原能力与2.04～2.46 mmol/L的FeSO4相当。

图1 阿魏酸总抗氧化能力（浓度-硫酸亚铁当量）Fig.1 The total antioxidant capacity of ferulic acid（concentration-ferrous sulfate equivalent）

2.1.2 阿魏酸自由基清除能力测定结果与分析

图2（a）是不同质量浓度的阿魏酸对DPPH自由基清除率的影响，阳性对照BHA、BHT和VC。在0.2 mmol/L时FA对DPPH自由基清除率明显比BHA、BHT和VC低。但随着FA质量浓度增大，其对DPPH自由基清除效果逐渐增强；在样品质量浓度为0.6～0.8 mmol/L时，FA对DPPH自由基的清除率高于BHA，却稍低于BHT和VC。而1.0 mmol/L的样品对DPPH自由基清除能力排序为VC>FA>BHT>BHA，说明当浓度为1.0 mmol/L时，FA有较强的DPPH自由基清除能力，清除率达到89.4%。

图2（b）是不同质量浓度的阿魏酸对羟基自由基清除率的影响，阳性对照BHA、BHT和VC。当样品浓度在2～10 mmol/L范围内时，FA对羟基的清除率均随着样品浓度的升高而逐渐增强，4者对羟基自由基的清除能力排序为VC>BHA>BHT>FA，说明2～10 mmol/L FA有较弱的羟基自由基的清除能力；当样品浓度为10 mmol/L时，FA对羟基的清除率达到51%，相当于VC对羟基自由基的清除能力的1/2。

图2（c）是不同质量浓度的阿魏酸对ABTS自由基清除率的影响，阳性对照BHA、BHT和VC。当样品质量浓度为0.5～1.5 mmol/L时，对ABTS自由基的清除能力排序为BHA>FA>VC>BHT，3者明显优于 BHT，且 BHA、BHT 随质量浓度变化不明显；当样品质量浓度为2 mmol/L时，对ABTS自由基的清除能力排序为BHA>VC>FA>BHT，相差不明显，但3者明显优于BHT；当FA质量浓度为2.5 mmol/L时，其对ABTS自由基清除率达到91.2%。

图2 阿魏酸及对照品对自由基清除能力的影响Fig.2 Effect of ferulic acid and reference on free radical scavenging ability

2.2 阿魏酸对试验菌株的抑菌性试验结果与分析

2.2.1 试探性预试验结果

如图3和图4所示，阿魏酸对试验霉菌菌株（黑曲霉和灰绿青霉）没有抑菌效果，但对试验细菌菌株（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）有明显的抑制效果。

图3 阿魏酸对试验霉菌菌株的抑菌性初探Fig.3 Preliminary study on the antibacterial activity of ferulic acid to experimental fungal strains

图4 阿魏酸对试验细菌菌株的抑菌性初探Fig.4 Preliminary study on the antibacterial activity of ferulic acid to experimental bacterial strains

2.2.2 阿魏酸对食品腐败细菌敏感性的测定结果

由表1可知，在样品浓度62.5～1 000 mg/mL范围内，FA和VC对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有不同程度的抑制作用，但BHA和BHT对3种菌均没有抑制作用。随着样品浓度的不断增加，FA和VC对3种菌的抑制作用逐渐增强。对大肠杆菌而言，FA变化趋势不明显，抑菌圈直径维持在8.0～8.5 mm之间，此时表明大肠杆菌对FA是耐药；VC对大肠杆菌的抑制作用不断增强，变化明显，大肠杆菌对62.5 mg/mL的VC是耐药，对125 mg/mL VC是中度耐药，对250～1 000 mg/mL VC是敏感。可以得出，随着样品浓度逐渐增大，VC对大肠杆菌的抑制作用明显强于FA。金黄色葡萄球菌对62.5 mg/mL FA是耐药，对125～250 mg/mL FA是中度耐药，对250～1 000 mg/mL FA是敏感；另外金黄色葡萄球菌对62.5 mg/mL的VC是耐药，对125 mg/mL VC是中度耐药，对250～1 000 mg/mL VC是敏感。可以得出，随着样品浓度逐渐增大，VC对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于FA。枯草芽孢杆菌对62.5 mg/mL FA和VC是中度耐药，对125～1 000 mg/mL FA和VC是敏感；可以得出，在同一浓度下，FA对枯草芽孢杆菌的抑制作用与VC相当，而且随着样品浓度逐渐增大，VC对金黄色葡萄球菌的抑制作用稍强于FA。

表1 阿魏酸及对照品对菌的敏感性测定Tab.1 Sensitivity determination of ferulic acid and reference substance to bacteria 单位：mm

由图5可知，在样品浓度为62.5 mg/mL时，BHA和BHT对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均无抑制作用；FA和VC对3者均有抑制作用，且FA和VC对3者的抑制效果强度顺序均为大肠杆菌<金黄色葡萄球菌<枯草芽孢杆菌。

图5 阿魏酸与对照品（浓度为62.5 mg/mL）对3种细菌抑菌试验图Fig.5 Antibacterial experiment of ferulic acid and reference substance（concentration：62.5 mg/mL）to three bacteria

2.2.3 阿魏酸最低抑菌浓度（MIC）的测定结果

由表2可知，阿魏酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为12.5，6.25，6.25 mg/mL；VC 对 3 种细菌的最低抑菌浓度均为6.25 mg/mL；乳酸链球菌素对3种细菌的最低抑菌浓度分别为100，100，12.5 mg/mL；脱氢乙酸钠对3种细菌的最低抑菌浓度分别为50，25，25 mg/mL。

表2 阿魏酸及对照品对3种细菌的最低抑菌浓度的测定Tab.2 Determination of the minimum inhibitory concentration of ferulic acid and reference substances to three bacteria 单位：mg/mL

由表2和表3可知，对于大肠杆菌，抑菌物质对其抑菌效果强弱顺序为VC>FA>脱氢乙酸钠>乳酸链球菌素，其中FA对大肠杆菌的抑菌效果近似是VC的1/2，脱氢乙酸钠对大肠杆菌的抑菌效果近似是乳酸链球菌素的2倍。对于金黄色葡萄球菌，抑菌物质对其抑菌效果强弱顺序为VC=FA>脱氢乙酸钠>乳酸链球菌素，其中FA对金黄色葡萄球菌的抑菌效果近似与VC相当，脱氢乙酸钠对金黄色葡萄球菌的抑菌效果近似是乳酸链球菌素的4倍。对于枯草芽孢杆菌，抑菌物质对其抑菌效果强弱顺序为VC=FA>乳酸链球菌素>脱氢乙酸钠，其中FA对枯草芽孢杆菌的抑菌效果近似与VC相当，脱氢乙酸钠对枯草芽孢杆菌的抑菌效果近似是乳酸链球菌素的1/2，是FA和VC的1/4；还发现乳酸链球菌素在抑制枯草芽孢杆菌时具有优势。

表3 不同浓度阿魏酸及对照品对3种细菌的影响Tab.3 Effects of ferulic acid and reference substance on the three bacteria at different concentrations

2.2.4 不同pH值对阿魏酸最低抑菌浓度（MIC）的影响

由表4可知，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，在培养基pH值为2～10范围内，FA对其的最低抑菌浓度随着pH值的增大出现先增大后减小的趋势，这是由于pH值较低时，强酸保护了FA，相当于提高FA试验浓度，而当pH值较高时，强碱中和了大部分FA，而且大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长在强碱环境中受到了抑制；对枯草芽孢杆菌而言，在培养基pH值为2～10范围内，FA对其的最低抑菌浓度随着pH值的增大出现一直增大的趋势，这可能与pH值较低时，强酸保护了FA，使得pH值为2～6时最低抑菌浓度<6.25 mg/mL，而当pH值较高时，强碱中和了FA，使得FA浓度大大减少，从而对枯草芽孢杆菌不产生抑菌性。

表4 pH值对阿魏酸的最低抑菌浓度的影响Tab.4 The effect of pH on the minimum inhibitory concentration of ferulic acid 单位：mg/mL

2.2.5 最低杀菌浓度（MBC）的测定

由表5可知，FA对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低杀菌浓度分别为200，大于400，200 mg/mL；VC对3种细菌的最低杀菌浓度分别为200，100，200 mg/mL；乳酸链球菌素对3种细菌最低杀菌浓度分别为400，400，25 mg/mL；脱氢乙酸钠对3种细菌的最低杀菌浓度分别为200，100，100 mg/mL。

表5 阿魏酸及对照品对三种细菌的最低杀菌浓度的测定Tab.5 Determination of the minimum bactericidal concentration of ferulic acid and reference substance to three bacteria 单位：mg/mL

由表5和表6可知，对于大肠杆菌，抑菌物质对其杀菌效果强弱顺序为VC=FA>脱氢乙酸钠>乳酸链球菌素，其中FA的杀菌效果近似与VC相当，脱氢乙酸钠的杀菌效果近似是乳酸链球菌素的2倍。对于金黄色葡萄球菌，抑菌物质对其杀菌效果强弱顺序为VC=脱氢乙酸钠>乳酸链球菌素>FA，其中VC的杀菌效果近似与脱氢乙酸钠相当，脱氢乙酸钠的杀菌效果近似是乳酸链球菌素的4倍。对于枯草芽孢杆菌，抑菌物质对其杀菌效果强弱顺序为乳酸链球菌素>脱氢乙酸钠>VC=FA，其中FA的杀菌效果近似与VC相当且最小，脱氢乙酸钠的杀菌效果近似是乳酸链球菌素的1/4，还发现乳酸链球菌素在杀死枯草芽孢杆菌时具有绝对优势。

表6 不同浓度阿魏酸及对照品对大肠杆菌的杀菌效果Tab.6 The bactericidal effect of ferulic acid and reference substance at different concentrations on E.coli

3 结语

通过阿魏酸体外抗氧化性研究表明，随着FA的质量浓度升高，其铁离子还原能力逐渐增大；随着FA的摩尔浓度升高，其对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基清除能力逐渐增大，其中FA对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力较高，均为90%左右，但对羟基自由基的清除能力较弱。

通过FA的抑菌活性研究表明，其对黑曲霉和灰绿青霉没有抑制作用，但对大肠杆菌有抑制效果，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌也有明显的抑制效果；随着FA浓度的不断增加，对3者的抑制作用逐渐增强，而且对3者的抑制效果强度顺序为大肠杆菌<金黄色葡萄球菌<枯草芽孢杆菌；FA对3者的最低抑菌浓度分别为12.5，6.25，6.25 mg/mL；FA对3者的最低杀菌浓度分别为200，大于400，200 mg/mL。此外，乳酸链球菌素在杀死枯草芽孢杆菌时具有绝对优势。本研究为阿魏酸抗氧化性和抑菌活性提供试验数据和理论依据，既有利于青麦仁的开发利用，实现其营养价值，又为阿魏酸性质研究提供理论基础，扩大其应用范围。