杨梅果核壳多酚超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性

刘 永，李烈秋，李晓帆

（肇庆学院 食品与制药工程学院，广东肇庆 526061）

0 引言

杨梅为我国南方特色水果，主要产自江苏、浙江、福建、广东等省份。成熟杨梅果实色泽鲜艳、酸甜可口、营养丰富、风味浓郁［1］，具有开胃生津、消食解暑、排毒养颜、益肾利尿等功效［2］。杨梅富含有机酸、维生素、花色苷和多酚等活性物质，具有抗菌、抗炎、抗氧化、降低血脂等作用［3］。杨梅成熟期正值高温多湿梅雨季节，果实呼吸作用旺盛、衰老过程很快，严重地影响了其食用价值［4］。无法鲜食的杨梅主要用于加工成果汁饮料、速溶果粉、果脯、果醋和果酒等产品［5］。杨梅产品加工过程中产生大量的果渣、果核等副产物，这些副产物含有大量多酚物质［6］。其中，副产物中的果核壳还没有得到充分的研究与利用。

天然多酚类物质主要来源于水果、蔬菜和其他植物，具有抗氧化、抑菌、抗衰老、降血脂血压等多种生理功能和药理作用［7］，引起许多研究者对其的开发与利用。近年来，从食品加工过程产生的副产品中提取与利用生物活性物质引起了广泛关注［8］。目前，对杨梅果核壳开发利用，特别对其多酚物质的提取回收、生物活性的研究鲜见报道。因此开发利用杨梅果核壳多酚具有重要的意义。本文利用超声辅助提取杨梅果核壳多酚，采用响应面优化提取工艺并研究其抗氧化活性，以期为杨梅果核壳多酚的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杨梅果核壳，果农提供；DPPH、ABTS、维生素C（VC）、过硫酸钾、没食子酸、水杨酸钠、过氧化氢购于麦克林试剂公司；福林酚试剂购于国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

H1650-W型高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；YQ120型超声波处理仪（上海易净超声仪器有限公司）；H1650Uvmini-1240型紫外可见分光光度计（岛津企业管理中国有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 杨梅果核壳多酚的提取

将新鲜杨梅果核壳洗净、烘干、粉碎过100目筛子得杨梅果核壳粉末。称取一定质量果核壳粉末倒入COD管中，按照料液比加入一定浓度乙醇溶液，密封放置于超声波处理仪提取一定时间后，取出以12 000 r/min离心作用15 min，取上层清液定容于容量瓶中。根据Folin-Ciocalteu方法测定提取多酚的质量［9］，按照下式计算杨梅果核壳多酚的提取率。

1.2.2 响应面优化杨梅果核壳多酚的提取工艺

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken设计原理，选择乙醇浓度、料液比、超声时间为提取工艺参数，以杨梅果核壳多酚的提取率为优化指标进行响应面优化提取工艺。

1.2.3 杨梅果核壳多酚抗氧化活性的测定

根据LIU等［10］的方法测定杨梅果核壳多酚清除DPPH、ABTS与OH自由基活性，以VC为对照进行评价杨梅果核壳多酚的抗氧化活性。

1.3 数据处理

数据平行测定3次，采用Design-Expert 8.0软件进行响应面优化，p< 0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验提取杨梅果核壳多酚

料液比对杨梅果核壳多酚提取率的影响见图1（a）。多酚提取率随料液比的增加先增后降，在1：30（g/mL）达到最大值。这可能是料液比的增加使提取基质细胞内部和外部的多酚物质质量浓度差增大，有利于多酚的提取［11］；但料液比超过1：30时，超声空化能量密度的降低占了主导地位，对多酚提取不利［12］。所以，选择料液比为1：30左右进行优化试验。

乙醇浓度对杨梅果核壳多酚提取率的影响见图1（b）。多酚提取率随乙醇浓度的增加先增后降，在乙醇浓度为50%时达到最大值。这可能与提取液的极性有关，不同浓度的乙醇溶液具有不同的极性，浓度为50%乙醇溶液的极性可能与杨梅果核壳多酚的极性相似，当乙醇浓度超过50%时，提取溶液的极性降低，导致提取率降低［13］。所以，选择乙醇浓度为50%左右进行优化试验。

超声时间对杨梅果核壳多酚提取率的影响见图1（c）。多酚随超声时间的增加先增后降，在40 min时提取率达到最大值。这可能是超声的机械搅动、空化和热效应可以促进提取物从基质细胞壁释放［14］，增加超声时间有利于多酚提取，但超声时间过长导致多酚降解，提取率降低［15］。因此，选择超声时间为40 min左右进行优化试验。

图1 各因素对杨梅果核壳多酚提取率的影响Fig.1 Effect of various factors on extraction ratio of red bayberry kernel shell polyphenols

2.2 响应面优化杨梅果核壳多酚提取工艺

2.2.1 方差分析

在单因素试验的基础上，以杨梅果核壳多酚提取率（Y，%）为优化目标，对乙醇浓度（X1，%）、料液比（X2，g/mL）和超声时间（X3，min）采用 3因素3水平进行响应面优化杨梅果核壳多酚的提取工艺。优化试验设计结果及方差分析见表1和见表2。

表1 响应面试验设计及试验结果Tab.1 Response surface test design and test results

表2 回归方程的方差分析Tab.2 Analysis of variance in regression equation

对表1的试验数据进行拟合得到杨梅果核壳多酚提取率（Y）与乙醇浓度（X1）、料液比（X2）和超声时间（X3）的三元二次回归方程：

根据回归方程方差分析的结果（表2）可知，回归方程的p值小于0.01，表明差异非常显著，试验方法可靠；失拟项的p值为0.063 6>0.05，表明失拟不显著，回归模型与实测值拟合良好；回归系数R2=0.987 5和Radj2=0.965 1，表明该回归方程具有良好的相关性，可以很好地反映杨梅果核壳多酚提取率（Y）与乙醇浓度（X1）、料液比（X2）及超声时间（X3）之间的关系。除了相互作用项（X1X2、X1X3、X2X3）外，一次项（X1、X2、X3）和二次项（X12、X22、X32）对多酚提取率都有显著影响（p<0.05）。根据F值的大小可知，3个因素对多酚提取率的影响大小顺序为X3>X2>X1。以上结果表明，该回归方程可以较好地分析和预测杨梅果核壳多酚的提取，优化的方程模型可靠。

2.2.2 响应曲面分析

乙醇浓度（X1）、料液比（X2）和超声时间（X3）对杨梅果核壳多酚提取率（Y）的三维曲面见图2，直观地显示了每个因素相互作用时响应面的3D轮廓。从响应曲面的3D轮廓和最高点可以看出，在所选因素水平的范围内存在一个极值，说明因素的水平选择合理。从图2中等高线图的形状可知，乙醇浓度（X1）和料液比（X2）、乙醇浓度（X1）和超声时间（X3）、料液比（X2）和超声时间（X3）之间的相互作用对多酚提取率（Y）影响不显著，这与表2中的方差分析结果一致。

图2 各因素对杨梅果核壳多酚提取率影响的三维曲面图Fig.2 3D diagram of the effect of various factors on extraction ratio of red bayberry kernel shell polyphenols

2.2.3 杨梅果核壳多酚最佳提取工艺的确定

根据Design-Expert软件的计算与实际操作的考虑，杨梅果核壳多酚最佳提取工艺：乙醇浓度为 44%，料液比 1：32（g/mL），超声时间为 44 min。此条件下进行3次平行试验，杨梅果核壳多酚的提取率为1.56%，与预测值偏差1.89%，说明该模型是可靠的。

2.3 杨梅果核壳多酚的抗氧化活性

从杨梅果核壳多酚以VC为对照清除DPPH、ABTS和OH自由基的能力（如图3）可知，杨梅果核壳多酚和VC清除上述3种自由基的能力随着样品浓度的增加而线性增加；杨梅果核壳多酚清除DPPH、ABTS和OH自由基的能力都略低于VC。杨梅果核壳多酚与VC清除DPPH自由基的线性回归方程分别为y=1.514 2x+0.038（R2=0.997 6）、y=1.582 4x+5.045 3（R2=0.995 1），根据回归方程计算的IC50分别为33.00 µg/mL与28.41 µg/mL，表明杨梅果核壳多酚相当于86.09%的VC清除DPPH自由基能力。杨梅果核壳多酚清除DPPH自由基能力比杨梅叶总黄酮（40 µg/mL，91%清除率）低［16］，但比杨梅果多酚（80 µg/mL，90%清除率）要高［17］。杨梅果核壳多酚与VC清除ABTS自由基的线性回归方程分别为y=0.798 1x+1.802 2（R2=0.998 8）、y=0.934 2x+4.435 1（R2=0.996 4），根据回归方程计算的IC50分别为60.39 µg/mL 与 48.77 µg/mL，表明杨梅果核壳多酚相当于80.76%的VC清除ABTS自由基能力。杨梅果核壳多酚清除ABTS自由基能力高于杨梅叶、枝、树皮（100 µg/mL，约38%清除率）与杨梅疏果核仁苦杏仁苷（IC50 为 281 µg/mL）［18］。杨梅果核壳多酚与VC清除OH自由基的线性回归方程分别为y=0.279 8x+3.354 7（R2=0.997 5）、y=0.301 1x+5.358（R2=0.999 7），根据回归方程计算的 IC50分别为 166.71 µg/mL 与 148.26 µg/mL，表明杨梅果核壳多酚相当于88.93%的VC清除OH自由基能力。杨梅果核壳多酚清除OH自由基能力低于杨梅果多酚（100 µg/mL，75%清除率）、杨梅渣多酚（100 µg/mL，93.2%清除率），但高于杨梅叶多糖（200 µg/mL，45%清除率）［19］。上述试验结果表明杨梅果核壳多酚具有较强的抗氧化活性，可以作为天然的抗氧化剂使用。

图3 样品对DPPH、ABTS和OH自由基的清除率Fig.3 The scavenging ratio of samples to DPPH，ABTS and OH radicals

3 结语

以杨梅果核壳为原料，利用超声辅助提取多酚，采用响应面法优化提取工艺并研究其抗氧化活性。最佳提取工艺为乙醇浓度44%、料液比1：32（g/mL）、超声时间 44 min，此条件下杨梅果核壳多酚提取率为1.56%。杨梅果核壳多酚对DPPH、ABTS和OH自由基清除的IC50分别为 33.00 µg/mL，60.39 µg/mL，166.71 µg/mL，分别相当于维生素C清除能力的86.09%、80.76%和88.93%，表明杨梅果核壳多酚具有较好的抗氧化活性，可以作为天然的抗氧化剂使用。