苹果组培外植体获取及培养试验研究

张秀英，张 丹，马勉娣，唐 昕，胡志芳，程安富，刘 毅，张孟艳，鲁兴凯*

（1.昭通市苹果产业发展中心，云南 昭阳 657000；2.镇雄县农业农村局经作办，云南 镇雄 657200）

苹果属（Malus Mill）是蔷薇科（Rosaceae）中一个属，全世界约有38种，分布于北美洲、亚洲和欧洲等地，具有较高的经济价值。中国约有30种，其中特有品种为16种[1]，是世界主要栽植果树品种之一。苹果组织培养技术不仅可对母本的优良性状进行保持、提纯或复壮，而且离体培养下繁殖体个体小、群体大，可控的环境还能消除季节因素的限制，从而显著地提高了繁殖效率，从而成为苹果植物快速繁殖的一条重要途径。

植物体中可选择茎尖、茎段、子叶、胚、原生质体和花药等作为外植体，通过不同培养途径获得再生植株，但不同外植体的再生能力不同，因此，合适外植体的选择是组织培养成功的前提。目前，利用苹果外植体进行组织培养的污染率参差不齐，重复性较差，应用效果不佳，有时污染率高达80%，严重制约了苹果组织培养进度。本试验就组培过程中外植体的获取方法进行了研究，为苹果组培苗木繁育技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

盆栽苗：取自昭通主栽品种（秦脆、瑞阳、华硕等）1年生幼苗。其他材料：MS培养基、蔗糖、琼脂、6-BA、吲哚丁酸（IBA）、聚乙烯醇、升汞（0.1%）、酒精（75%）等。

1.2 试验方法

1.2.1 前处理

在早春2—3月，将前1年移栽或嫁接成活的苹果盆栽苗移入温室，适应高温环境，待萌芽抽枝后，放入人工气候箱内进行恒温热处理。处理温度调节在37℃、湿度90%、每天光照12.5 h，光照度为22000 Lx，处理时间35 d。

1.2.2 切取外植体

待人工气候箱内的盆栽苗萌发抽生新枝，顶芽或腋芽萌发长度达到0.5～2 cm时，立即剪取茎尖（叶片较多的茎尖部位要去除多余的叶子，只保留生长点附近1～2片叶）及芽点放入装有自来水的烧杯中，防止失水枯萎。剪取时要尽量靠近生长点，距离生长点0.5 cm左右为宜。芽点剪取方法见图1。

图1 茎尖及芽点切取图

1.2.3 自来水冲洗

先在装有外植体的烧杯上方蒙上一层纱布，再在自来水下冲洗30～40 min，去除采集的外植体上的灰尘等。

1.2.4 酒精消毒

将冲洗完毕的外植体拿到超净工作台上进行消毒处理，自来水倒掉后，倒入75%酒精，并计时浸泡30 s，随后用无菌水冲洗2～3遍。

1.2.5 升汞消毒

酒精消毒后外植体放入0.1%升汞中消毒5～7 min，再用无菌水浸洗3～5遍。

1.2.6 分化增殖培养

将升汞消毒后的外植体接种在MS培养基上，附加6-BA 0.8 mg·L-1，IBA 0.2 mg·L-1，蔗糖40 g·L-1，琼脂6 g·L-1，聚乙烯醇2 g·L-1，pH值6.0[2]。

1.3 指标计算方法

污染率（%）=（真菌或者细菌污染的芽数/供试芽数）×100

成活率（%）=（未死亡的芽数/未被污染的芽数）×100

2 结果与分析

由表1可以看出，通过此方法获取组培外植体，与常规获取组培外植体相比，增加了恒温热处理步骤，同时规定了外植体长度、消毒步骤，利用苹果在高温条件下生长出来的茎尖及芽点进行接种培养，使得染菌率低至0%；但剪取的芽点长度直接影响组培苗的成活率，当外植体长度小于0.5 cm时，由于幼嫩芽体耐受性差，芽点褐化严重，所以成活率只有35%；当外植体长度在0.5～2 cm时，成活率能达到85%以上，且繁殖能力非常强。分化增殖培养后的芽点生长情况见图2。

表1 切取的芽点长度对组培苗成活率的影响

图2 分化增殖培养后的芽点生长情况

3 讨论

在植物组织培养中，关于组培方面的报道很多，但利用苹果外植体进行组织培养的污染率参差不齐，成活率不高，重复性较差，应用效果不佳，有时污染率高达80%，严重制约了苹果组织培养进度，因而如何降低生产成本，简化工艺，提高繁殖系数和成活率，达到规模化、商品化生产是组培技术研究的重要方向[3]。陈冉冉等通过剥取苹果砧木系SH6茎尖培养组培苗，成活率仅为20%[4]。庞曼等通过研究苹果外植体的消毒方法，污染率最低为48%，成活率最高仅为42%[5]。本实验研究利用苹果热处理脱毒方法，通过规定所取外植体长度、消毒步骤，显著降低了利用外植体获得组培苗的染菌率，低至0%，较之前技术相比提高了75%～92%；同时显著提高了利用外植体获得组培苗的成活率，达到85%，且繁殖能力非常强。