金钗石斛多糖对非酒精性脂肪肝病大鼠TLR4和HO-1表达的影响*

喻 涓，范 艳，杨榆青，何 丹，宋 波，姚 政△

1云南师范大学医院，云南 昆明650500；2云南中医药大学基础医学院；3昆明医科大学基础医学院

随着人们饮食结构的变化，非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）发病率逐年升高［1］。NAFLD疾病谱较广，包括单纯性NAFLD、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic fatty hepatitis，NASH）、非酒精性肝纤维化、肝硬化等，主要病理特征为肝脏脂肪蓄积和肝细胞实质脂肪变性［2］。有研究显示，NAFLD已经成为世界各国最常见的慢性肝病，甚至也成为肝纤维化和肝硬化的主要病因［3］。对于本病，临床中并没有特效药，因此开发新的药物对于本病意义重大。金钗石斛是我国经典名贵中药材之一［3］，相关研究［4-5］表明，金钗石斛多糖是金钗石斛主要的有效药理成分之一，其在抗肿瘤、促进免疫反应、抗氧化以及消炎方面均具有很好的效果。目前金钗石斛多糖对NAFLD的作用尚无文献报道，为此本研究采用高脂高糖饮食构建NAFLD大鼠模型，观察其对肝功能、炎性因子的影响，并从TLR4和HO-1蛋白分析和探讨其可能的作用机制，为金钗石斛多糖的开发和NAFLD的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性清洁级SD大鼠72只，体质量160～180 g，购于昆明医科大学动物实验中心，实验动物许可证号：SCXK-（云）2011-004，大鼠购买后饲养于云南中医药大学动物实验房，由专业人员统一饲养，实验室温度、湿度及光照时间按照标准统一设定。

1.2 实验仪器PT-3502型酶标仪（北京普天新桥技术有限公司）；752N型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；XSP-9CA型光学显微镜（上海光学仪器厂）；EMUC7型石蜡切片机（德国徕卡）；PPDT-12C1型梯度脱水机（湖北徕克医疗仪器有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白电泳仪（美国伯乐）；StepOne TM型实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）。

1.3 药物及试剂普通饲料、高脂饲料［昆明医科大学动物实验中心，实验动物许可证号：苏饲证（2018）10030］；金钗石斛多糖（浓度98%，上海融禾医药科技发展有限公司，批号：180615）；多烯磷脂酰胆碱胶囊［赛诺菲（北京）制药有限公司，批号：180726］；多聚甲醛（淄博齐星化学科技有限公司，批号：180707）；天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）（南京建成生物工程研究所，批号：180822）；血清白细胞介素6（interleukin-6，IL-6，批号：180911）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（武汉博士德生物工程有限公司，批号：180706）；BCA蛋白定量试剂盒（上海泽叶生物科技有限公司，批号：181009）；Toll样受体4（Toll-like receptors-4，TLR4）、血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）［赛信通（上海）生物试剂有限公司，批号：181115、181205］；引物（上海生物生工）。

1.4 分组及造模1）所有大鼠购买后按照随机数字法分为正常组，模型组，多烯磷脂酰胆碱组，金钗石斛多糖高、中、低剂量组，每组12只，分组后适应性喂养1周后给予相应饲料造模。除正常组外，其余各组给予高脂饲料喂养制备NAFLD大鼠模型，8周后每组各取2只检验造模是否成功，造模成功标准为大鼠肝脏切片HE染色有明显脂肪颗粒浸润，同时血清肝功能AST和ALT明显升高。2）正常组和模型组给予2 mL生理盐水灌胃，多烯磷脂酰胆碱组给予23 mg/（kg·d）多烯磷脂酰胆碱灌胃，灌胃时将其溶于2 mL的生理盐水中，金钗石斛多糖低、中和高剂量组分别给予金钗石斛多糖50、100、200 mg/（kg·d）灌胃，灌胃时将其溶于2 mL的生理盐水中，灌胃4周后处死大鼠，进行后续试验。

1.5 观察指标大鼠于处死前夜禁食不禁水12 h，然后采用3%的戊巴比妥溶液8 mL腹腔注射麻醉，麻醉后将其固定于解剖版，采用腹主动脉取血法收集血液，血液收集后于4℃、离心半径6 cm，4000 r/min离心10 min，收集血清，将其置入超低温冰箱中用于相关生化指标的检测，完成后取出肝脏，切取肝脏组织约2 mm3，置入4%的多聚甲醛溶液中用于组织病理学检测，其余组织置入超低温冰箱中，用于TLR4和HO-1蛋白和mRNA的检测。

1.5.1 一般情况 于每次喂食和喂水前观察并记录大鼠活动状况，同时统计饮食量，观察毛色和精神状态。

1.5.2 肝功能及炎性因子指标 血清ALT和AST的测定严格按照试剂盒提供的说明书进行，采用分光光度计测定。血清IL-6和TNF-α的测定严格按照试剂盒提供的说明书进行，采用酶标仪测定。

1.5.3 组织病理学观察 肝脏组织病理学检测采用HE染色法，从浸泡24 h的多聚甲醛溶液中取出肝脏组织，自来水反复冲洗24 h后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，完成后石蜡包埋，切片机切成3～5 μm厚薄片，脱蜡后依次经苏木精和伊红染色，最后中性树胶封片即完成。

1.5.4 采用Western blot测定大鼠蛋白表达 称取1 g肝脏组织，用组织裂解液充分裂解后取上清，BCA法测定蛋白浓度后调平，然后每组各取50 μg行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后，半干转移法转移到PVDF膜，脱脂牛奶封闭后洗涤，加入一抗［TLR4（1∶2000），HO-1（1∶1000），β-actin（1：5000）］孵育后洗涤，加入二抗（1∶5000）孵育并洗涤，暗室曝光进行洗片和定影，结果以目的蛋白与β-actin积分光密度值比值表示，每组实验重复3次。

1.5.5 采用QT-PCR检测肝组织TLR4和HO-1 mRNA表达 采用总RNA试剂盒提取总RNA后，将其逆转录为cDNA后，每组取2 μg行实时荧光定量PCR扩增反应，扩增条件为95℃2 min、94℃10 s、60℃10 s、72℃40 s，循环次数36次。分析方法选用2-ΔΔCt法，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，经检验所有数据均符合正态分布，多组间比较采用F检验，组间比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况各组大鼠均未死亡，此外正常组精神饱满，活泼好动，毛色光滑，大小便正常；模型组大鼠出现明显精神萎靡、活动量降低、毛色发黄灰暗及尿液发臭，相较于模型组，多烯磷脂酰胆碱组和金钗石斛多糖各组精神状态有一定好转，活动量增加，毛色较光泽。

2.2 肝功能及炎症因子水平与正常组比较，模型组大鼠AST、ALT、IL-6、TNF-α水平均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，多烯磷脂酰胆碱组和金钗石斛多糖各剂量组上述指标均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；金钗石斛多糖各剂量组AST、ALT水平与多烯磷脂酰胆碱组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；金钗石斛多糖中、高剂量组IL-6和TNF-α水平明显低于多烯磷脂酰胆碱组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肝功能指标及炎症因子水平比较（±s）

表2 各组大鼠肝功能指标及炎症因子水平比较（±s）

注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与多烯磷脂酰胆碱组比较，P＜0.05

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2.3 大鼠肝脏HE染色观察正常组大鼠肝脏组织细胞核大小均一，形态正常，无纤维和组织增生；模型组大鼠则出现明显被脂肪空泡，肝小叶明显破坏，同时细胞排列紊乱，有一定程度炎症浸润，与模型组相比，多烯磷脂酰胆碱组和金钗石斛多糖各剂量组脂肪浸润程度明显降低，炎性浸润降低，肝脏整体外观明显改善。其中金钗石斛多糖各剂量组肝组织病理改善最为明显，脂肪颗粒显著减少，且肝小叶清晰，改善程度呈现明显剂量依赖性。见图1。

图1 各组大鼠肝脏组织切片（HE×400）

2.4 TLR4和HO-1蛋白及mRNA表达与正常组比较，模型组肝脏组织中TLR4和HO-1蛋白及mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，多烯磷脂酰胆碱组和金钗石斛多糖各剂量组TLR4和HO-1蛋白及mRNA表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；金钗石斛多糖中、高剂量组TLR4和HO-1蛋白及mRNA表达明显低于多烯磷脂酰胆碱组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表3。

图2 各组大鼠肝脏组织TLR4和HO-1蛋白表达

表3 各组大鼠肝脏组织中TLR4和HO-1蛋白及mRNA的相对表达量比较（±s）

表3 各组大鼠肝脏组织中TLR4和HO-1蛋白及mRNA的相对表达量比较（±s）

注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与多烯磷脂酰胆碱组比较，P＜0.05

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3 讨论

目前文献［6-11］中报道较多单纯高脂和胆碱-蛋氨酸缺乏饮食诱导的NAFLD模型。单纯高脂高糖饮食可以模拟出胰岛素抵抗型动物模型，胆碱-蛋氨酸缺乏饮食则可以诱导脂肪肝同时并发胆囊损坏模型。本研究根据药物特点，选用了高脂高糖饮食诱导型，本模型目前在造模方法上已经完全成熟，此外价格相对便宜。由于金钗石斛多糖具有一定的降血糖效果［12］，以此动物模型来验证药物效果具有针对性。

近年来，关于金钗石斛多糖药理学研究受到越来越多学者的关注，如国内宾捷等［13］研究发现金钗石斛在提高衰老小鼠机体的抗氧化能力方面具有很好的效果，可抑制血清中NDA的升高，同时增加抗氧化因子SOD和GSH的活性。此外关于金钗石斛多糖的抗癌、消炎作用有文献报道［14-15］，国内学者［16］采用金钗石斛多糖治疗高脂血症的Wistar大鼠研究结果表明，金钗石斛多糖可明显降低血清总胆固醇和甘油三酯水平。

ALT和AST是重要的肝功能评价指标，其中ALT主要存在于肝脏、心肌和骨骼肌。ALT能够准确反映肝细胞的损伤程度，此外ALT的升高多见于肝脏的急性损伤。AST则主要在心肌、肝及肾组织线粒体中，AST主要对应的为肝细胞的慢性损伤［17-18］。本实验研究结果发现，给予NAFLD大鼠金钗石斛多糖治疗，大鼠肝功能指标AST和ALT相较于模型组明显降低，这证实金钗石斛多糖对NAFLD大鼠肝功能具有调节作用。在NAFLD大鼠肝功能损伤过程中TLR信号通路和HO-1信号通路参与了其炎症反应的进程［19］，其中TLR属于模式识别受体，在进化中具有高速保守性，目前研究发现TLR家族主要有12个重要成员，研究最多的为TLR4，TLR4信号通路主要介导肝损伤过程中IL-6、TNF-α的应答。在炎症反应的过程中HO家族蛋白和TLR家族蛋白相互作用，共同促进疾病的发生和进展，HO家族相关蛋白是身体内重要的应激反应蛋白的一种，其也是一种起始酶和限速酶，可有效的催化血红素降解过程，在NAFLD发生后，机体处于低氧状态，同时有部分内毒素刺激，可造成HO-1分泌的增加，HO-1分泌的增加可降低组织炎症反应，进而对肝细胞起到保护作用。本次研究结果显示，与正常组相比，模型组TLR4和HO-1蛋白及mRNA表达明显升高，同时TLR4调控的下游炎性因子IL-6和TNF-α也明显升高，这提示在NAFLD发生和发展过程中，炎症反应可随着NAFLD的发生而升高，采用金钗石斛多糖治疗后，大鼠肝脏中正常组大鼠TLR4和HO-1蛋白及mRNA、IL-6和TNF-α均明显降低，这提示金钗石斛多糖对NAFLD大鼠炎症反应具有改善作用。

综上所述，金钗石斛多糖可明显改善受损的NAFLD肝脏，改善肝功能，这与金钗石斛多糖可下调HO-1和TLR4表达，进而降低炎症反应刺激有关。