渤海S油田油藏硫酸盐还原古菌分析

张世仑，王大威，尹榆钧，靖 波，王秀军

(1. 海洋石油高效开发国家重点实验室，北京 100028；2.中海油研究总院有限责任公司，北京 100028；3. 南开大学 生命科学学院 分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津 300071)

目前，从油田中分离出来的硫酸盐还原古菌只有属于广古菌门的极端嗜热菌——古球菌(Archaeoglobus)，它能以硫酸盐和硫代硫酸盐为电子受体而利用脂肪酸(C4～C8)[16-17]。尽管古菌在地下生物圈的占比很小[18]，但其所具备的硫酸盐还原功能可追溯至生命起源的早期，亦不可忽视。

本研究通过高通量测序技术，对渤海S油田油藏内源古菌的群落组成和多样性进行分析，构建硫酸盐还原功能基因的分子进化树，并且比较油田H2S治理井与非治理井之间古菌群落组成的差异，以期证实古菌对油藏环境的酸蚀作用，进而有助于工业系统因地制宜地选择适当的SRPs生物抑制策略。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

SpectroBlue型电感耦合等离子发射光谱仪，德国Spectro公司；ICS-1100型离子色谱仪，Thermo Fisher公司；AxyPrepTM细菌基因组DNA试剂盒，Axygen Biosciences公司；EmeraldAmp©PCR反应混合物，TaKaRa公司；ABI GeneAmp©9700型热循环仪，Applied Biosystems公司；IlluminaMiseq测序平台，上海美吉生物医药科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油田采出液取样

取1只容量为25 L的塑料桶，用医用酒精洗2～3次；根据井口压力选择性接上高(低)压取样器，打开取样阀，让采出液流出5～10 min并冲洗塑料桶2～3次；将采出液灌满塑料桶，每口井25 L(其中原油至少1 L，地层水至少10 L)，拧紧盖子密闭常温保存(注意：冬季防冻结、夏季防暴晒)；样品采集后尽快运送至实验室进行预处理。

1.2.2 样品离子参数检测

将采出液样品进行离心(12 000 r/min 离心5 min)，取中间清液通过0.22 μm滤膜，收集滤液，使用电感耦合等离子发射光谱仪、离子色谱仪分别对滤液中的阳、阴离子含量进行检测。

1.2.3 样品菌体收集

针对采集样品的水相部分，直接采用离心法(12 000 r/min，离心5 min)收集其中的菌体；针对油相部分，预先与异辛烷混合，充分溶解得到单一相，再进行离心(12 000 r/min，离心20 min)收集沉淀；将上层液相通过0.22 μm滤膜，过滤收集菌体。

1.2.4 样品DNA提取

取菌液20 mL于离心管中，12 000 r/min离心10 min；菌体用1 mL Lysis buffer洗2次后用0.6 mL Lysis buffer重悬并加入0.2 g玻璃珠研磨1 min，重复3次，加入终质量浓度为10 mg/mL的溶菌酶在37 ℃下反应1 h；加入120 μL 200 g/L的SDS在65 ℃下反应1 h；使用AxyPrepTM细菌基因组DNA试剂盒完成后续提取(具体方法步骤参照说明书)。

1.2.5 古菌群落组成分析

使用通用引物524F10extF(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)和Arch958RmodR(5’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)对上述样品的DNA进行古菌16S rRNA基因PCR扩增[19]，PCR反应体系(2×Taq PCR Master Mix 10 μL，重蒸水12 μL，正、反向引物各1 μL，DNA 1 μL)，PCR反应程序(预变性温度95 ℃，保持5 min；35个循环：变性温度95 ℃，保持30 s；退火温度52 ℃，保持30 s；延伸温度72 ℃，保持1 min；终延伸温度72 ℃，保持10 min)；PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行微生物群落组成和多样性分析。

1.2.6 硫酸盐还原功能基因扩增

基于硫酸盐还原功能基因及其对应引物：aprA(aprA-1-FW：5’-TGGCAGATCATGATYMAYGG-3’和aprA-5-RV：5’-GCGCCAACNGGDCCRTA-3’)[20]、dsrA(DSR-1Fdeg：5’-ACSCAYTGGAARCACG-3’和PJdsr853Rdeg：5’-CGGTGMAGYTCRTCCTG-3’)[21]、dsrB(DSRp2060F：5’-CAACATCGTYCAYACCCAGGG-3’和DSR4R：5’-GTGTAGCAGTTACCGCA-3’)[22]，分别对上述样品的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系与反应程序与古菌16S rRNA基因PCR扩增的相同。

1.2.7 功能基因进化树构建

将硫酸盐还原功能基因PCR产物割胶回收，纯化后的DNA配制T载体连接体系(DNA 4.5 μL，Solution I 5 μL，pMD©19-T Simple Vector 0.5 μL)；从平板上挑取白色单克隆经PCR鉴定之后送样测序[23]；利用EMBOSS Transeq将基因序列翻译成相应的蛋白质序列，使用CD-Hit Suite将蛋白质序列分类得到不同的操作分类单元(OTU)[24]；与NCBI数据库进行比对，获得相似性较高的参考序列，将参考序列和OTU代表序列一起导入MEGA7.0软件中，使用Neighbor-joining方法构建功能基因进化树[25]。

1.2.8 热力图聚类分析

采用距离计算算法：样本间为spearman[26]，采用的聚类方法为hcluster(complete算法)[27]。

1.2.9 国际基因库测序接受号

采出液样品古菌高通量测序原始数据上传至NCBI的SRA(Sequence Read Archive)数据库，接受号为SRR10489661～SRR10489664、PRJNA643651。硫酸盐还原功能基因测序数据上传至NCBI的GenBank数据库，aprA基因接受号为MN392725～MN392899，dsrA基因接受号为MN417336～MN417496，dsrB基因接受号为MN431958～MN432152。

2 结果与讨论

2.1 古菌群落多样性分析

为了研究采出液样品古菌群落组成及多样性信息，选取古菌16S rRNA基因测序获得的OTU代表性序列，与NCBI数据库进行比对获得古菌的注释信息。基于古菌注释信息，计算各古菌的相对丰度，绘制古菌相对丰度分布图，结果见图1。由图1可知：产甲烷古菌(Methanomassiliicoccales、Methanobacteriales、Methanofastidiosales和Methanomethyliales)合计占比近60%；具有硫酸盐还原功能的热球菌(Thermococcales)、古球菌(Archaeoglobales)和脱硫球菌(Desulfurococcales)各自占比分别为0.30%、0.59%和2.96%。

图1 古菌相对丰度分布图

相比于产甲烷古菌，硫酸盐还原古菌虽不占优势，但它们能够利用各式各样的电子受体(硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物、硝酸盐、亚硝酸盐、延胡索酸盐和CO2)，这种代谢功能多样化的优势有助于它们在电子受体枯竭时，拥有在环境中存活下去的机会[28]。

2.2 硫酸盐还原功能基因进化研究

硫酸盐还原功能基因的分子进化树及相对丰度如图2所示。由图2(a)可知：样品aprA基因共计8个OTU，有6种类型菌。其中，OTUaprA-8源自闪烁古球菌(Archaeoglobusfulgidus)，Thermodesulfobacterium占绝对优势，古球菌(Archaeoglobus)占比1.71%。

图2 硫酸盐还原功能基因分子进化树及相对丰度

由图2(b)可知：样品dsrA基因共计15个OTU，有10种类型菌，其中，OTUdsrA-12源自Archaeoglobusfulgidus，OTUdsrA-13、OTUdsrA-14和OTUdsrA-15源自Archaeoglobussulfaticallidus，古球菌(Archaeoglobus)为绝对优势菌，占比57.76%。

由图2(c)可知：样品dsrB基因共计18个OTU，有17种类型菌，多样性较高。其中，OTUdsrB-13源自Archaeoglobusfulgidus，Desulfurispora与古球菌(Archaeoglobus)为优势菌，分别占比38.46%、17.44%。

综上可知，古球菌的硫酸盐还原功能基因以异化型亚硫酸盐还原酶(DSR)为主，介导亚硫酸盐生成硫化物这一反应过程。

2.3 生物抑制作用对硫酸盐还原古菌的影响

2.3.1 离子参数分析

表1 采出液样品离子参数

2.3.2 古菌群落组成差异分析

为了比较X1、X2两类井采出液样品古菌群落组成的差异，研究样品群落的情况，获得古菌的注释信息，再基于古菌注释信息，绘制采出液样品古菌相对丰度分布，结果见图3。由图3可知：产甲烷古菌(Methanosaeta、Methanothermobacter和Methanomethylicus)为优势菌群，在两类井中的占比近90%。具有硫酸盐还原功能的热球菌(Thermococcus)在X1、X2中的丰度分别为1.51%和1.15%。由此可见，相比非治理井，硫化氢治理井中的硫酸盐还原古菌热球菌(Thermococcus)的丰度下降了23.84%，这说明BCX治理措施不仅对能够还原硫酸盐的细菌增殖有抑制作用，而且也能下调硫酸盐还原古菌的菌群占比。

图3 古菌相对丰度分布对比图

2.3.3 热力图(Heatmap)聚类分析

图4为样品古菌相对丰度的热力图，色块颜色越红，该类型菌的丰度在样品中越高。由图4可知：硫化氢治理井X2与非治理井X1之间古生菌的组成存在明显差异，活性相对较高的菌种有Methanosaeta、Methanothermobacter、Methanomethylicus和Thermococcus等；还可以看出Thermococcus(热球菌)在X1井中的丰度要高于X2井中的。

色块颜色梯度显示样品中各菌种的丰度，即颜色越红，丰度越高

3 结论

我国海上油田微生物的防腐工作尚处于发展研究阶段，充分认识目标油藏环境的微生物生态结构和功能，是揭示油藏酸蚀机制和建立防护措施的必经之路。本研究以渤海油田的硫化氢治理井为研究对象，借助高通量测序技术等分子生物学方法，得出以下结论：

1)对渤海S油田油藏古菌的群落结构进行分析，找到了具有硫酸盐还原作用的3种古菌：热球菌(Thermococcales)、古球菌(Archaeoglobales)、脱硫球菌(Desulfurococcales)。

2)探究了硫酸盐还原功能基因aprA、dsrA和dsrB在油田各类内源微生物中的丰度情况，发现古球菌的占比在dsrA、dsrB中呈现优势，说明古球菌对异化型亚硫酸盐还原反应过程有着重要的影响。

3)分析了生物竞争抑制(BCX)对热球菌丰度的影响，发现热球菌在H2S治理井中的丰度要低于非治理井，说明BCX对硫酸盐还原古菌产生了有效的抑制作用。

这些结果既为揭示油藏深部硫酸盐还原反应引发酸蚀效应的机制提供了新视角，也有助于制定有针对性的油田次生H2S生物抑制策略。