汉逊德巴利酵母L1-1发酵槐花提取物产香气物质及其应用

张倩颖，罗 诚，李东亮，丁重阳

(1.四川中烟工业有限责任公司 技术中心，四川 成都 610066；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122)

香精香料在食品、饲料、化妆品、化学和制药等领域具有极其重要的作用，与人们日常生活息息相关。使用香精香料能够改进产品性能，提升品质[1]。传统香精香料的配制方法多以天然提取或化学合成的单体混合调配而成，难以形成具有独特香气的香精香料[2]。

微生物发酵能够产生种类多样的香气物质，形成丰富而独特的香气[2-4]。随着人们对绿色健康生活的追求，利用微生物制备安全绿色的天然香精香料成为研究热点。目前，已有100多种利用细菌、真菌和酵母等微生物制备的天然香精香料实现了商品化[5]。

本研究将德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)L1-1、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)CICC1960和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BNCC185415这3株产香酵母与薰衣草、玫瑰花、紫罗兰、菊花、槐花、桂花和白芍花这7种具有独特香韵的花进行组合发酵，筛选出一组菌株-花组合。在此基础上以感官为导向，采用单因素法和田口实验设计法对培养基进行优化，得到一个最优培养基并从中提取制备出一种风格独特的天然香料，分析了提取物中半挥发性成分及常见香气成分。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

汉逊德巴利酵母L1-1、树干毕赤酵母CICC1960和酿酒酵母BNCC185415保藏于江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室。

1.1.2 主要仪器设备

Trace 1310-ISQ LT型三重四级杆气相色谱-质谱联用仪，美国Thermo公司；二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)固相微萃取萃取头，美国Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养

种子培养基：马铃薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L。

菌株活化：取-80 ℃保藏的菌株转接入种子培养基，28 ℃培养48 h，活化2代，待用。

菌株发酵：接种活化好的菌株于发酵培养基28 ℃培养5 d。

1.2.2 酵母-花组合筛选

将活化后的德巴利酵母L1-1、树干毕赤酵母CICC1960和酿酒酵母BNCC185415等3株酵母接种于灭菌的薰衣草、玫瑰花、紫罗兰、菊花、槐花、桂花和白芍花，产生21种酵母-花组合，灭菌钥勺混匀，28 ℃培养5 d，发酵结束后对产物进行提取，对提取物进行产香效果评价，选取对卷烟品质具有显著提升效果的酵母-花组合，进行后续培养基优化研究。

1.2.3 发酵培养基优化

单因素实验：以槐花为基础培养基，分别添加不同质量的葡萄糖、甘油、豆粕粉、玉米粉、土豆汁、麦芽糖、麸皮、蔗糖及果糖，发酵结束后对产物进行提取，对提取物进行产香效果评价，以筛选对产香有促进作用的因子。

田口实验：根据单因素实验结果，选取对菌株产香具有促进作用的因子进行后续优化实验。综合田口实验原理，以评吸结果为响应值，实验设计及数据分析皆采用JMP软件(version 10.0，SAS Institute Inc.)，因素编码及自变量水平见表1。

表1 田口实验变量及编码水平

1.2.4 产香效果评价

由经验丰富的卷烟感官评定专家对提取物进行嗅香，筛选出香味与烟香协调、对卷烟品质可能有提升的提取物，加入卷烟进行卷烟加香评吸。

卷烟加香评吸：取2 μL提取物加入卷烟烟丝，在恒温恒湿箱内调节烟支水分48 h，温度(22±1) ℃，相对湿度60%±3%。参照《YC/T 138—1998烟草及烟草制品·感官评价方法》[6]，由经验丰富的感官评定专家，对卷烟样品进行评吸。

根据评吸结果，由香气特征、烟气特征及口感特征这三方面进行赋分，81～95分为极显著提高卷烟质量(+++)，66～80分为显著提高卷烟质量(++)，51～65分为提高卷烟质量(++)，36～50分为与空白对照组相似(±)，21～35分为降低卷烟感官质量(-)，6～20分为显著降低卷烟感官质量(--)。

1.2.5 发酵液中半挥发性物质分析

采用顶空固相微萃取结合气质联用(SPME-GC/MS)测定提取物中半挥发性物质，以2-辛醇为内标。顶空固相微萃取条件：萃取头在GC进样口老化至无杂峰，在60 ℃下萃取30 min，被吸附的半挥发性化合物在GC进样口260 ℃解吸1 min，冲入GC色谱柱，同时启动仪器采集数据。气相色谱条件：色谱柱为DB/WAX，载气为He，流速为1.2 mL/min；程序升温条件为50 ℃维持2 min，3 ℃/min升温至180 ℃，15 ℃/min升温至230 ℃，维持8 min。质谱条件：接口温度230 ℃，离子源温度260 ℃，四级杆温度150 ℃，电离电势70 eV，离子化模式EI+，质量扫描范围(m/z)为33～350。检测获得的质谱数据经过与NIST标准质谱检索库进行检索比对鉴定，由内标法计算各组分的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 酵母-花组合筛选

将3株产香效果较好的酵母菌接种于7种特色植物进行发酵，观察酵母发酵情况，发现从第2天开始，酵母菌在7种植物组成的培养基中均有明显生长。选取菌株长势良好的培养物进行提取，选取嗅香较好且可能对卷烟品质具有显著提升的样品进行卷烟加香评吸，嗅香及评吸结果见表2。

表2 嗅香及评吸结果

由表2可知：与对照相比，发酵后的样品外香发生了明显变化，香气变化程度和对卷烟品质影响程度与菌株和底物均有明显关系。具体来说，经过3株酵母发酵后的薰衣草组样品和树干毕赤酵母CICC1960发酵玫瑰花样品中表现出了不愉快的香气，气味较未发酵样品差；发酵后的紫罗兰和白芍花香气变化较大，但与对照相比，卷烟感官品质提升不明显，汉逊德巴利酵母L1-1发酵后的紫罗兰和白芍花样品甚至降低了卷烟的感官品质；经发酵后的菊花提取物均带有酱甜香气，菊花组提取物在卷烟刺激和杂气等方面有所改善；汉逊德巴利酵母L1-1和酿酒酵母BNCC185415发酵后的桂花提取物，特征香气较未发酵提取物弱，但加入卷烟后能够丰富卷烟烟香、改善余味和增强回甜感；汉逊德巴利酵母L1-1和树干毕赤酵母CICC1960发酵后的槐花提取物均表现为“弱槐花特有香气，带清甜酒香”，但是对卷烟的感官影响差异较大，前者表现为“丰富香韵，增加烟气浓度和饱满度，降低刺激性(++)”，后者表现为“烟气浑浊、发干，刺激增大，口腔辣苦(--)”。

槐花(FlosSophorae)是豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的花朵，乳白色，蝶形花冠，为我国首批药食同源的花卉植物。槐花不仅营养丰富，还含有刀豆酸、槐花二醇、芦丁和槲皮素等活性物质[7]，且香气素雅、清香持久[8]，是一种具有开发利用价值的香味原料。汉逊德巴利酵母为常见的生香酵母，发酵时会产生较淡的甜酯香，略带酒香，被广泛应用于肉制品的制备中[9]。本研究的所有提取物中，汉逊德巴利酵母L1-1发酵槐花的提取物对卷烟品质提升具有最显著的影响(++)，目前，尚无用汉逊德巴利酵母发酵槐花生产天然香精香料的报道。因此，本文选取汉逊德巴利酵母L1-1发酵槐花进行后续培养基优化。

2.2 单因素实验

在槐花培养基中加入不同质量浓度的常见食品级葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、甘油、玉米粉、豆粕粉、土豆汁和麸皮，接种汉逊德巴利酵母L1-1培养后，对培养物进行提取，提取物记为HD，由经验丰富的卷烟评吸专家进行效果评价，嗅香和评吸结果见表3。

表3 嗅香及评吸结果

根据评吸结果，初步筛选出与烟香协调且对卷烟质量效果具有较强提升作用(评吸结果“++”和“+++”)的HD葡-1、HD豆-1、HD豆-3、HD玉-1、HD麦-2和HD果-1，由经验丰富的卷烟评吸专家对卷烟进行复评，结果见表4。

表4 复评结果

根据感官评吸结果，筛选葡萄糖、豆粕粉、玉米粉、麦芽糖和果糖等5个因子进行田口实验。

2.3 田口实验

田口设计(Taguchi design)实质上是利用正交数组进行设计实验，其能够在众多实验变量中筛选出最少变量以满足实验需要[10]。在优化设计中利用田口设计具有多个变量能够被同时优化，在较少的实验组数中能够得到较多相关因子的定量信息等优点[11]，已经被广泛应用于发酵工业[12-14]。根据单因素实验结果，以发酵提取物感官评吸平均值为响应，对培养基进行优化，田口实验设计培养基方案及评吸赋值结果见表5。

对表5中实验结果进行方差分析，结果见表6。

表5 田口实验设计及响应值

表6 回归方程方差分析

表7 偏回归系数及显著性检验

由表7可知：对汉逊德巴利酵母L1-1发酵槐花发酵产物感官评定具有显著影响的因素有葡萄糖、豆粕粉、麦芽糖和果糖(P<0.05)。同时，软件给出了感官评定分值最高时的最优培养基配方：X1(葡萄糖)、X2(豆粕粉)、X3(玉米粉)、X4(麦芽糖)和X5(果糖)分别对应水平L3、L2、L2、L3和L2，预测评吸值(图1中以Y表示)为80.6分，其概率(图1中以意愿表示)为88.06%(图1)。意愿为达到软件预测的感官最大值的概率。红色的L2和L3等为软件预测最大响应下，即软件预测的最大评吸值下对应因素的水平，红色为软件自带。

图1 软件预测评吸最大值

在软件给出的最优条件下进行3次平行实验，将该培养基发酵提取物加入卷烟进行评吸，与空白卷烟相比，加香卷烟烟香丰富、烟气蓬松流畅、圆润、细腻，刺激性降低，得出评吸值为(88±2)分，实验值和理论值的相对标准偏差(RSD)为9.18%。可见，本研究采用的单因素实验结合田口实验设计，对汉逊德巴利酵母L1-1发酵槐花培养基进行优化效果良好。

2.4 发酵液半挥发性物质测定

测定汉逊德巴利酵母L1-1发酵槐花提取物(HD)半挥发性物质，以槐花未发酵样品提取物(记为H)作为对照，总离子流图见图2，成分分析结果见表8。

图2 未发酵(a)与发酵(b)槐花提取物总离子流

由表8可知：在2个样品中共鉴定出51种半挥发性物质。在H样品中共鉴定出33种半挥发性物质，半挥发性物质的总含量为2 424.00 mg/L，其中2-乙基己酸和芳樟醇为含量最高的2种物质，含量分别为334.45和332.36 mg/L。在HD中共检出41种半挥发性物质，半挥发性物质的总含量为8 821.7 mg/L，其中苯乙醇和芳樟醇为含量最高的2种物质，含量分别为4 293.99和1 798.64 mg/L。

表8 半挥发性物质

进一步分析半挥发性物质中常见的香味物质，发现在H和HD样品中，共检出29种常见香味物质，包括异戊醇、异丁酸、正戊醇、正己醇、乙酸异戊酯、苯甲醇、壬醛、异戊酸、苯乙烯、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、3-辛酮、苯乙酮、芳樟醇、脱氢芳樟醇、苯乙醇、冰片、松油烯-4-醇、α-松油醇、桃金娘烯醇、异戊酸芳樟酯、香芹醇、橙花醇、邻氨基苯甲酸甲酯、丁香酚、γ-壬内酯、茉莉酮、月桂醇和β-紫罗兰酮。在H中，香味物质包括除3-辛酮、脱氢芳樟醇、冰片、桃金娘烯醇、香芹醇、丁香酚和月桂醇外的22种物质。这22种香味物质总量为1 780.66 mg/L，其中含量较高的香味物质主要有芳樟醇、松油烯-4-醇、α-松油醇、异戊醇、苯乙醇和橙花醇(332.36～110.57 mg/L)，这6种物质总量占香味物质总量的70.1%。在HD中，也包含22种常见香味物质，具体为除异戊醇、异丁酸、正戊醇、正己醇、乙酸异戊酯、苯甲醇和壬醛等7种物质以外的物质。在HD中存在的这22种香味物质总量为7 798.00 mg/L，其中苯乙醇、芳樟醇和α-松油醇(838.49～4 293.99 mg/L)含量较高，这3种物质总量占香味物质含量的88.8%。

异戊醇、异丁酸、正戊醇、正己醇、乙酸异戊酯、苯甲醇、壬醛、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、松油烯-4-醇、邻氨基苯甲酸甲酯和β-紫罗兰酮等12种香味物质仅在H中被鉴定出或含量高于HD中，3-辛酮、脱氢芳樟醇、冰片、桃金娘烯醇、香芹醇、丁香酚、月桂醇、异戊酸、苯乙烯、苯乙酮、异戊酸芳樟酯和γ-壬内酯等12种香味物质则表现出相反的趋势。值得注意的是，在HD中苯乙醇、芳樟醇和α-松油醇等3种物质分别为H的23.2倍、5.4倍和4.1倍。苯乙醇具有水果样的味道，在卷烟中能够掩盖杂气，增加细腻柔和度，提高香气；芳樟醇具有典型的花香香气、柔和透发，在卷烟中与烟香协调，能够增加花香、清香，修饰和矫正自然风味，吸味柔和；α-松油醇具有鲜幽香气，稀释后有似桃甜香，与烟香协调，赋予果香和辛香，改善烟气新鲜风味[15]。汉逊德巴利酵母L1-1能够通过一系列分解代谢，利用初始培养基中包含12种香味物质在内的物质，经过合成代谢转化为包含另外12种香味物质在内的产物，最终使得发酵后的培养物呈现出“槐花特征香韵减弱、香韵更加柔和且略带酒香”的特征香韵。

3 结论

从21种酵母-花组合中，筛选得到了一种风格独特的具有开发成为天然香料潜力的汉逊德巴利酵母L1-1槐花组合。通过单因素实验和田口实验得到了一种最优培养基，并制备出了一种香气独特的天然香料。该香料能够增加卷烟甜花香韵，使烟气圆润、细腻，降低刺激性。SPME-GC/MS分析表明，该香料中共检出41种半挥发性物质，其中包括22种常见香气成分；未发酵时常见香味物质含量为1 780.66 mg/L，经过发酵处理香味物质含量增加到了7 798.00 mg/L，苯乙醇、芳樟醇和α-松油醇含量为未发酵样品的23.2倍、5.4倍和4.1倍。

通过本研究的发酵策略，改变了槐花特征香气，得到了一种香气独特的天然香料，但是本研究仅研究了发酵前后提取物中半挥发性物质的变化情况，德巴利酵母L1-1发酵槐花产香作用机制和代谢途径等有待深入研究。