酶回用技术在纤维素乙醇领域的应用研究进展

周娜娜，李冬敏，武国庆,2

(1. 中粮营养健康研究院 生物技术中心，北京 102209；2.国家能源生物液体燃料研发(实验)中心，北京 100020)

在纤维素乙醇生产过程中，木质纤维素原料首先通过预处理打开其致密结构，随后与纤维素酶充分接触，将聚糖转化成可发酵的单糖[1]。商业化的纤维素酶已经显示出较高的水解活性，但在纤维素乙醇生产中的酶成本仍占总成本的20%～30%[2]，成为限制木质纤维素利用的关键因素之一[3]。因此，如何减少木质纤维素水解过程中酶用量成为业界研究的热点。

近年来，相关研究多聚焦于通过提高酶促水解产率的方法来降低酶加量，如添加表面活性剂[4]、分批加入底物[5]或采用先进的反应器原位脱除产物以减轻抑制等[6-7]。然而这些方法仍未解决酶成本高的问题。Visser等[8]研究发现，在水解完成后酶蛋白仍会保持较高活性，回用酶解终点的活性酶，可以有效降低新体系中的酶用量，从而降低整体的酶消耗量，因此酶回用被认为是一种有潜力的方法[9]。与木质纤维素水解相关的酶，特别是纤维素酶的循环使用一直被大家研究[10]，通常认为酶回用的效率与底物性质、酶种类及反应条件等密切相关。其中，底物性质取决于预处理的方式，不同的预处理方式对底物的结构特性会产生不同的影响，使得底物的纤维结构和木质素含量发生变化[11]，进而影响酶对于底物的吸附效果和酶回用的效率[12]。这些研究提出了多种酶回用的方法，部分方法有望应用于规模化生产。

本文中，笔者分析了预处理方式对酶吸附的影响，阐述酶与底物吸附的机制，归纳影响酶与底物吸附的因素，并综述多种酶的回用策略，从降低酶成本的角度探讨酶回用在工业中的应用潜力，希望对纤维素乙醇行业的发展有所借鉴。

1 木质纤维素降解酶吸附机制及影响因素

木质纤维素降解酶在木质纤维素上的吸附和脱附是一个复杂的过程，不仅与底物结构及降解酶的吸附特性有关，而且还受到水解体系参数如pH、表面活性剂等的影响[13]。因此，深入理解木质纤维素降解酶在底物上的吸附脱附过程是实现酶回用的基础。

1.1 预处理方式对于酶吸附的影响

木质纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，主要包括纤维素(35%～50%)、半纤维素(20%～35%)和木质素(15%～20%)等[14]。纤维素的基本结构单元是微纤丝，由D-葡萄糖组成的均一无分支长链，葡萄糖单元间由β-1,4-糖苷键连接而成[15]。纤维素具有结晶结构，在天然状态下呈现Ⅰα和Ⅰβ，而且两者几乎在所有天然状态下都可共存[16](图1(a))。半纤维素常常是高度分支的、有取代基的异质聚糖，在纤维素乙醇生产原料——农作物废弃物的半纤维素结构中，木糖分子以β-1,4-糖苷键相互连接形成木聚糖骨架，侧链含有L-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸等[17](图1(b))。木质素是一个复杂的网络，由苯丙烷单元聚合而成，构成了木质纤维素最丰富的非糖组分，由愈创木基丙烷、对羟苯基丙烷和紫丁香基丙烷这3种基本的结构单元组成。(图1(c))[15]，它们互相交织，形成抗降解的复杂网络结构。

图1 木质纤维素的主要组成成分

这种复杂的结构通常需要通过预处理来破坏，增加木质纤维素降解酶对底物的可及性[18]，进而实现木质纤维素原料的高值化利用。然而，不同的预处理方法对底物结构及组分变化造成不同的影响，如果改变底物的结构特性，则导致底物对降解酶的吸附呈现明显的差异，最终影响酶解的效率。常用的纤维素预处理方法有很多，具有工业化潜力的主要有3种，即稀酸预处理、中性蒸汽爆破预处理和碱性预处理。稀酸预处理主要是去除半纤维素，而纤维素和木质素基本保留[19]，这就导致一部分纤维素酶会不可逆地吸附到木质素上，不但会降低纤维素的降解效果，而且也不利于酶的循环利用。中性蒸汽爆破预处理可以去除约50%半纤维素[20]及部分木质素，并导致部分纤维素结构重排[21]，这样，降解酶吸附到木质素上的比例大幅度减少。碱性预处理可以改变纤维素晶型，并使大部分木质素溶解[19]，降解酶在纤维素和半纤维素水解完成后处于游离状态。

Lu等[12]研究不同预处理方式对酶吸附的影响时发现，碱性汽爆与中性汽爆相比，预处理后物料的木质素含量由46.1%降至8.2%，在相同酶加量下可更快速被水解，且纤维素酶吸附比例减少。Qi等[22]对麦秆进行不同方式的预处理后发现：与碱性预处理相比，酸性预处理的物料木质素含量从20.5%降至3.6%；通过吸附等温式分析发现，酸性预处理底物的酶吸附力是0.217 L/g，高于碱性预处理底物的0.138 L/g。这均说明预处理物料中木质素含量对于酶吸附有显著影响。

1.2 木质纤维素降解酶的吸附机制

在发酵前，预处理物料中的成分主要为纤维素、部分半纤维素和木质素，其水解需要多种酶协同作用，包括纤维素酶、木聚糖酶及多种辅助酶类等[1,18]。

虽然纤维素结构单一，但是纤维素的降解需要多种纤维素酶的协同作用才能完成。降解纤维素的酶类主要包括纤维二糖水解酶(CBH)、β-1,4-内切纤维素酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BG)。CBH主要作用于纤维素结晶区的还原性或非还原性末端，产生纤维二糖单元；EG主要作用于纤维素的无定形区，在内部随机切断纤维素长链，并为CBH提供作用末端；BG主要将CBH产生的纤维二糖水解成葡萄糖[14]。辅助蛋白如膨胀因子(swollenin)、裂解多糖单加氧酶(LPMO)等分别通过剥离微纤丝束和氧化断键打破纤维素的结晶结构，促进纤维素的降解[24](图2)。

图2 纤维素酶对于纤维素的协同降解[36]

大部分纤维素酶都由催化核心(CD)和碳水化合物结合模块(CBM)组成[25]。纤维素酶吸附至不溶纤维素上，是反应的第一步，在这个过程中，CBM发挥着关键作用。CBM在降解结晶纤维素时，主要通过几个芳香族氨基酸经π-电子相互作用和氢键相互作用吸附在底物上[26]，将CD区拉近至不溶性纤维素表面[27]。CD区通过芳香族和极性氨基酸与底物形成氢键和疏水相互作用，促使聚糖的糖苷键断裂，发生水解。这些相互作用的强度决定了酶对于底物的吸附强弱[16]。与纤维素酶类似，LPMO也有CBM[16]，其CBM只起到辅助增强的作用[28]。纤维素酶和LPMO对纤维素的吸附是可逆的，且在酶分子与纤维素结合时需要纤维素的糖链具有一定的长度，当糖链水解至一定程度，酶的CD区就无法继续与糖链结合从而自动解吸，重新释放到水解体系中，吸附到其他的纤维素分子上继续进行水解反应[29]。纤维素酶和LPMO同样可以通过氢键、静电或疏水相互作用吸附到木质素上[30-31]，由于木质素无法被纤维素酶降解，使得这种吸附作用不可逆，从而成为酶有效循环的最大障碍。但是，利用碱性亚硫酸盐等预处理可以将木质素磺化成木质素磺酸盐，成为一种表面活性剂，就可减少木质素对酶的无效吸附，有利于酶的脱附和循环利用[32]。

与纤维素酶结构类似，木聚糖酶不仅可以吸附在半纤维素上，还可以与纤维素和木质素结合[33]，CBM的存在可以增强这种吸附效果[34]。有些纤维素酶(如β-葡萄糖苷酶)不具有CBM，对于纤维素吸附较弱，只能作用于游离态的二糖单元。但也有些不含CBM的纤维素酶和木聚糖酶却可以作用于纤维素上，而且对于木质素具有不同的亲和力，这说明CBM不是影响吸附的唯一因素[35]，CD区在酶与底物结合时也发挥一定的作用。

1.3 影响酶与底物吸附的因素

除了受到底物性质和酶吸附特性的影响，酶的吸附和脱附过程还受到反应体系的pH、表面活性剂等因素的影响。

pH影响酶与底物的吸附状态。pH的改变会使酶分子的氨基酸带电荷状态发生变化，从而导致酶分子的构象改变；同样，木质纤维素底物上的活性基团也会因得到或失去质子而发生构象变化，影响酶在底物上的吸附[37]。当水解体系的pH为4～5时，酶分子在木质纤维素底物上吸附较多，而当pH调整为中性或碱性，则利于酶的脱附[38]，且吸附在木质素上的酶比纤维素上的更易被洗脱下来[39]。但是，通过调节pH来回收酶的方法受到酶的稳定性的限制，因为通过此方法来回收得到的酶活性差异较大，有的可以回收74%的酶活性[40]，而有些回收的酶活性为10%左右[41]。

酶与底物的相互作用是一个动态过程，酶在底物上的吸附与脱附同时存在，表面活性剂如吐温80(Tween 80)、聚乙二醇和牛血清白蛋白(BSA)等，可以与酶竞争性吸附到木质素上，减少木质素对酶的吸附，促进酶的脱附和循环利用[42-43]。但是，表面活性剂的使用也增加了成本，而且其效果依赖于底物种类和预处理的类型，通常在高木质素含量的底物水解时效果明显，而低木质素含量的底物使用表面活性剂的效果就很微弱[44]。

2 酶回用技术

木质纤维素对底物的降解过程与酶在底物上吸附和脱附过程密切相关，酶吸附到底物上则开始水解，水解完成后脱附，再重新吸附到新底物上，进行下一轮水解。利用这一特性，在酶解反应结束后，将纤维素酶进行回用，有可能降低酶用量和使用成本。从纤维素乙醇的生产过程来看，在纤维素乙醇的酶解工段或发酵工段实施酶回用可以使得水解体系中相当比例的活性酶被重新利用[8]。目前研究及生产中应用的酶回用方法主要分为四类：酶解上清液回用、酶解残渣回用、酶解液整体回用以及发酵醪液和蒸馏残液的回用。

2.1 酶解上清液的回用

酶解上清液是指将纤维素乙醇酶解工段的酶解液通过离心或过滤方式将固液分离后得到的上清液。因此酶解上清液的回用主要通过两种方式实现，一种是超滤回收上清液中的游离酶，另一种是利用新鲜底物吸附的游离酶进行回用。影响上清液回用的主要因素是纤维素和半纤维素的水解率，水解率越高，游离的纤维素酶和木聚糖酶就越多，越利于游离酶的回用。需要注意的是，如果将酶解液固液分离后的上清液直接循环使用，上清液中的糖对下一步水解起到明显的抑制作用[45-46]。

Steele等[47]利用氨纤维爆破玉米秸秆进行酶回用研究时发现：结合超滤的方法可以回收60%～66.6%的纤维素酶、76.4%～88%的纤维二糖水解酶，循环3次后，葡萄糖产率仍可达到70%；同时，基于Aspen plus的工艺模型，将酶循环前后的总成本进行了比较，基于0.5美元/kg的酶价格、在酶加量15 FPU/g葡聚糖和纤维素酶且60%的酶活性能循环回用的条件下，成本降低约15%。Tu等[48]通过简单的经济分析模型进行酶回用的成本核算：假设酶回收过程不需要额外的资金和运营成本，纤维素酶再循环用于蒸汽爆破的美国黑松(SELP)为底物的连续两轮水解，以纤维素酶成本为0.13美元/L乙醇、Tween 80价格为0.5美元/kg为前提，在SELP的水解中，乙醇成本降低8.6%。同样Tu等[11]利用诺维信纤维素酶Cellulast 1.5L和杜邦Spezyme CP通过添加表面活性剂分别进行酶回用试验，将吸附有游离酶的2%乙醇预处理美国黑松(EPLP)添加至含β-葡萄糖苷酶的缓冲液中并用于下一轮水解，纤维素酶Cellulast 1.5L和Spezyme CP可以循环3次而无明显的水解率下降。此试验的成本依赖于Tween 80和纤维素酶的价格：以纤维素酶成本为0.13美元/L乙醇、Tween 80价格为0.5美元/kg为前提，纤维素转化率90%保持不变，生产1 L乙醇的Tween 80成本增加0.12美元，而酶成本减少0.1美元，总成本(不计算额外的回收成本)增加，故而此法不可取。Qi等[49]通过超滤膜筛选，选择PES10超滤膜回收73.9%的纤维素酶，还利用纳滤膜NF270将糖液从30.2 g/L浓缩至110.2 g/L，但是此试验未考虑膜使用与酶回收的成本问题。

酶解上清液的回用可避免木质素的积累对酶活性的损害，为了使得上清液中含有更多游离酶，就需要确保底物的高水解率及低木质素含量。利用新鲜底物吸附或超滤的方法对于清液中的酶进行回用，虽然可以避免上清液直接回用而引入的糖抑制，但是需要重点考虑酶回用的成本是否被降低：在超滤回收酶的过程中需要核算节约的酶成本是否超过超滤膜成本，利用新鲜底物吸附酶的方法需要核算节约的酶成本是否可以弥补添加表面活性剂所产生的成本，同时还要考虑超滤引起的糖损失和超滤膜的回用次数。

2.2 酶解残渣的回用

酶解残渣的回用主要是纤维素乙醇酶解工段的酶解液经固液分离获得固体残渣的循环利用。通常酶解过程结束后，酶解体系中相当比例的纤维素酶存在于固体残渣中，因此固体残渣的循环可以达到较好的酶回收效果。

Xin等[50]将氨预处理的玉米秸秆水解残渣直接回用，可节约诺维信纤维素酶Cellic CTec2用量30%；此试验中假设纤维素乙醇生产中直接利用清液发酵，固液分离的成本可以忽略不计，依据Cellic CTec2生产乙醇的酶成本为每升0.13美元[51]，可降低酶成本0.04美元。但是，利用高速离心机来回收酶，离心条件是10 000g、10 min，一般工业离心机达不到这个离心系数，因此工业级的回用成本还需验证。Weiss等[52]将稀酸预处理玉米秸秆水解72 h后固液分离，回用固体残渣，初始固形物(TS)15%，固体残渣85%循环3轮之后,在保持水解率不变的情况下可以节约用酶33%, 他们也是通过高速离心的方法回收酶，离心条件为4 000g、20 min，离心系数更接近与工业离心机，但考虑到工业中连续生产的情况，离心时间较长，因此还需缩短离心时间才能验证回用方式是否可行。有专利提出，对生物质处理4～6 h，固液分离将吸附酶的固体流送回糖化单元，约70%的酶循环到新酶解系统中[53]，对于酶解残渣的回用具有借鉴意义。

固体残渣回用可以使未被水解的纤维素进入下一轮继续水解，提高了底物的利用率[54-55]。但是，残渣中木质素的积累会导致体系中可水解组分比例降低，而体系中固形物含量增加，则会影响搅拌和传质，所以需要容积更大的反应器。Qi等[22]在测定循环后酶解体系的木质素含量时发现，酶循环3次后，酸性预处理底物中的木质素含量由20.7%升至27.6%，碱性预处理底物中木质素含量由3.7%提高至9.5%，相比之下，碱性预处理的木质素积累速度明显较低。由此可见，酶解残渣循环的酶回用方式更适用于偏碱性预处理的物料，这些物料中的木质素大部分被转化为可溶性物质，解决了木质素积累的问题。此外，由于纤维素酶中的β-葡萄糖苷酶缺少CBM区，对于固体残渣的吸附力较弱，因此固体残渣的循环会导致此酶的缺失，在实际应用时还要视具体情况决定是否补加β-葡萄糖苷酶。

2.3 酶解液整体的回用

通常酶解液离心后，体系中添加的酶在上清液和固体残渣中均有分布，为了有效地进行酶循环，甚至可将存在于酶解液中的酶全部循环利用[13]，即酶解液整体回用以提高酶的循环效率。

Tu等[56]采用诺维信纤维素酶Cellulast和Novozym188探索了吸附于残渣中酶的最佳洗脱条件，并将洗脱的酶添加至含β-葡萄糖苷酶Novozym188的新酶解体系中，结合新鲜底物吸附，3轮水解后纤维素转化率仍可达到88%，每次洗脱过程所需Tween 80约0.2 g，而纤维素酶Cellulast(51.4 FPU/mL)起始添加0.2 g，基于纤维素酶单价远高于Tween 80，用等量的Tween 80替代纤维素酶是经济的。但是，此研究中，他们没有详细核算操作成本。

对酶解液固液分离后上清液和固体残渣中的酶均进行回用，可以提高回用效率，但是操作工艺要比单独的酶解上清液或者固相残渣循环更加复杂，最终的操作成本可能会更高。

2.4 发酵醪液及蒸馏残液的回用

发酵醪液或蒸馏残液的回用省去了离心步骤，如果在操作过程中只循环部分浆液，可减少能量消耗[1]。因为发酵醪液中含有较少的糖，对酶的影响较小，但是发酵产物乙醇对酶活性的影响需要考虑。

在工业生产中，整体发酵醪液的循环易于实现，醪液的循环使得水解体系的TS含量降低，乙醇浓度保持不变。在Inbicon的示范工厂中，将发酵醪液的20%在干物质含量为20.5%的酶解体系中回用，在保持纤维素转化率和最终乙醇浓度不变的条件下，纤维素酶用量降低约5%[40]。在中试装置上，发酵醪液在干物含量25%的酶解体系中回用，这使得体系中酶制剂Novozyme188和纤维素酶混合物的酶加量降为原始酶加量的59%和41%[57]。但是，对于发酵醪液循环而言，仅有部分醪液循环会导致可回用酶的比例减少[57]，而且醪液中乙醇含量、未发酵的木糖和木质素会对水解产生抑制作用[40,58]。为避免发酵产物对酶回用的影响，可以将乙醇蒸馏后的废醪液进行循环利用。由于传统的乙醇蒸馏工艺会使酶失活，因此，需要利用控制温度低于60 ℃的减压蒸馏发酵醪液，将蒸馏残液导入酶解罐进行酶回用，循环1～2次，可降低酶用量20%～25%[59]。鲍杰等[60]利用间歇减压蒸馏原位分离乙醇，并将蒸馏残液循环至新体系进行同步糖化发酵，最终的乙醇产率提高18.3%。

发酵醪液和蒸馏残液的部分回用在工业应用中易于操作，能回收和循环部分酶，显著降低酶用量，但其经济可行性仍需进一步验证。

这4种酶回用技术对降低酶成本都起到积极的作用，基于现有研究，节约50%～60%甚至更多的酶是有可能的[1]。Gregg等[61]利用技术经济性评价模型评估发现，采用酶回用可以使乙醇成本降低12%。Gomes等[62]研究认为，只要酶价格降低不少于34%，酶回用便经济可行。在实际工业生产中，无论采用哪种酶回用技术都需根据实际情况而定，不同预处理方式得到的底物结构不同，从而影响酶回用方式的选择。在选择酶回用的方式时，需要考虑在实际的循环体系中是否包含抑制酶或酵母活性的物质，这些抑制物是否会积累，能否被去除。对于酸性或中性预处理的底物，酶解后固体残渣木质素含量较高，不利于循环利用，可选择酶解上清液回用；上清液回用需要较好的固液分离工艺，并结合新鲜底物吸附或膜浓缩来回收酶，不影响体系的干物含量，并能减少酶的抑制物。对于氨纤维爆破、氨水/NaOH蒸煮等碱性预处理方法，可以将底物中的木质素转化成一种表面活性剂，减少酶的无效吸附[63]，可选择酶解残渣回用；这种循环通常需要定期清除固体残渣来减少木质素的积累，并通过在每一轮循环中添加β-葡萄糖苷酶来弥补关键酶组分的损失。对于同步糖化发酵工艺，适用于发酵醪液或蒸馏残液的循环，这一过程需要避免醪液中有机酸和其他发酵副产物等的积累[64]。此外，影响纤维素乙醇生产成本的因素很多[65]，如原料、预处理方式、酶回用增加的操作成本及酶回用节约的酶成本等，在测算成本时应综合考虑这些因素。

3 结论与展望

在纤维素乙醇研究领域，酶循环利用已经研究了多年。酶回用技术可以在一定程度上减少纤维素乙醇的生产成本，主要分为酶解上清液回用、酶解残渣回用、酶解液整体回用以及发酵醪液与蒸馏残液回用4种方式。不同酶回用方式的选择主要取决于物料预处理的方式、工艺可行性和操作成本。目前，这4种酶回用方式已经进行大量实验室研究及初步的成本核算，但是仍需建立准确的技术经济模型来评估可行性，为实现工业化应用奠定坚实可靠的基础，更多新技术和新工艺的开发也将大大推动酶回用技术在纤维素乙醇生产中的应用。