少根根霉及其产物的研究进展

朱洪霞，刘 欢，张亚鹏，刘 鑫，范天一，王 芳，邓 利

(北京化工大学 生命科学与技术学院 北京市生物加工过程重点实验室，北京 100029)

少根根霉(Rhizopusarrhizus)是一种常见的丝状真菌，广泛存在于植物、动物及土壤中。少根根霉的研究始于20世纪，因其具有产物种类多、营养要求简单、环境适应能力强、生长迅速等优点而被应用于多种领域。少根根霉应用最广泛的异名是米根霉，可分为原变种、东京变种和德氏变种这3个变种[1]，其发酵产物包括有机酸及酶类，可作为重要的原料和高效催化剂应用于化工、医药及食品领域。同时，少根根霉菌丝体在作为酶固定化载体和有害物质吸附介质方面有较大的利用价值。

近年来，富马酸的市场需求量逐渐增大，尤其是在食品和医药领域：富马酸可作为酸味剂用于食品加工，富马酸及其聚合物作为医用材料的前体在医药领域也逐渐得到应用[2]。少根根霉是发酵产富马酸的主要微生物，其酶系丰富，可产脂肪酶、淀粉酶等，具有广泛的底物适应性。目前，发酵用于廉价可再生原料绿色生制造平台化合物(如富马酸、脂肪酶、淀粉酶、纤溶酶及乙醇等)的底物有葡萄糖、甘油、木糖、木质纤维素及餐厨废弃物等[3-5]。由于添加不同底物，少根根霉生长状态各有不同，其偏重产物也有所差别，所以本文对少根根霉生产不同产物的研究进行总结，并对其产物及菌丝体的利用进行介绍。

1 少根根霉产富马酸

富马酸是一种天然存在的有机酸，是三羧酸循环的一个中间体，也是美国能源部优先发展的十二种平台化合物之一[6]。富马酸因分子量小、缓冲能力强，可作为柠檬酸的替代品[7]，它不仅可作为酸味剂、防腐剂添加到食品中，还可作为多种药物合成的前体[8-9]。早在1911年，Ehrlich就发现根霉菌具有生产富马酸的能力，随后Foster等[10]从8个不同种属的微生物中筛选了41株菌，经鉴定后发现根霉菌的富马酸产量最高。目前报道的富马酸生产有化学合成法和微生物发酵法[11]，相比于化学合成法，微生物发酵法以其原料可再生、绿色环保等优点成为常用的工业化生产富马酸的方法[12]，少根根霉因富马酸产量高也成为发酵产富马酸的优势菌。

1.1 少根根霉产富马酸的代谢机制

富马酸在根霉体内的积累机制一直受到广泛关注，目前公认的是Osmani等[13]提出的“胞液途径”学说。Wright等[14]利用同位素标记法建立了根霉菌以葡萄糖为碳源的代谢模型，利用14C同位素标记葡萄糖，分析根霉菌代谢过程中的各种产物，证实了富马酸是由胞液途径转化而来。甘油、木糖、淀粉等碳源经糖酵解等途径转化为丙酮酸，其中一部分流向线粒体，经氧化后进入三羧酸循环，为细胞生长提供能量，另一部分留在胞质中转化为草酰乙酸，进一步经苹果酸生成富马酸，同时，丙酮酸也可在胞质中转化为乙醇、乙酸和乳酸等其他产物，代谢途径如图1所示。

(1)—己糖激酶；(2)—葡萄糖磷酸异构酶；(3)—6-磷酸果糖激酶；(4)—醛缩酶；(5)—磷酸丙糖异构酶；(6)—磷酸甘油醛脱氢酶；(7)—磷酸甘油酸激酶；(8)—磷酸甘油酸变位酶；(9)—烯醇化酶；(10)—丙酮酸激酶；(11)—丙酮酸脱氢酶系；NAD—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADP—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；ADP—腺嘌呤核苷二磷酸；ATP—腺嘌呤核苷三磷酸；TCA—三羧酸循环

1.2 少根根霉产富马酸发酵工艺研究

少根根霉已被证明是较理想的富马酸生产菌株，并且众多研究者对其发酵生产过程进行了探究和优化。在传统的发酵过程中，多以葡萄糖为发酵原料，成本较高，有与人争粮、与粮争地的缺点[15]，因此，研究少根根霉对廉价碳源的高效利用对节约资源、降低生产成本有重要意义。从目前的研究结果来看，木糖、木薯粉、粗甘油等可在一定程度上替代葡萄糖作为少根根霉发酵生产富马酸的碳源，研究人员通过探究不通碳源条件下少根根霉发酵产富马酸的状况来扩大少根根霉的碳源适用范围，相关研究结果见表1[16-24]。由表1可知：少根根霉利用餐厨垃圾及水解液等原料发酵生产富马酸的产量还较低，但我国目前存在大量的此类资源，因此对这些资源的高效利用还需进一步研究，若能提高对餐厨垃圾及工业副产物水解物的利用率，这在资源的再利用方面具有重要的意义。有关少根根霉利用不同原料发酵产富马酸的情况如表1所示。

表1 少根根霉发酵不同碳源产富马酸

另外，为了改良发酵工艺，李鑫等[25]研究了外源添加苹果酸、草酰乙酸、丙酮酸对米根霉产富马酸的影响，结果发现添加适当浓度的中间代谢物均会使富马酸产量提高。基于少根根霉具有良好附着性的特点,Gu等[26]和Liu等[27]采用网布固定菌丝体进行发酵，发酵时间与游离态细胞发酵时间相比缩短83.3%，而富马酸产量却十分接近(分别为32.03和31.23 g/L)，这不仅改进了富马酸的发酵方式，也节约了发酵时间。Liu等[28]采用类似的方法进行放大研究，在5 L搅拌式反应器中以丝瓜瓤作为载体固定少根根霉生产富马酸，其产量达46.8 g/L，此方法不仅解决了菌丝不耐剪切的问题，也为富马酸的工业生产提供了一种新的工艺。

2 少根根霉产脂肪酶

脂肪酶(lipase,EC 3.1.1.3)又称三酰基甘油酰基水解酶，可将甘油三酯水解为脂肪酸、甘油二酯、单甘酯和甘油。脂肪酶的获取途径主要有提取法、微生物发酵法等，其中微生物发酵法因环境污染小且生产成本较低成为目前生产脂肪酶的主要方法。脂肪酶因其高度的选择性和专一性而广泛应用于食品加工[29-30]、药物合成[31]以及生物柴油转化[32]等领域。

2.1 少根根霉产脂肪酶菌种选育

真菌来源的脂肪酶由于其高度的稳定性而被广泛研究，且部分已被制成商品化酶制剂[33]。根霉所产的脂肪酶优先水解饱和脂肪酸链，具有较强的sn-1,3位专一性，应用价值较高[34]。少根根霉是一种低等真菌，想对其进行定向的基因改造存在一定的困难，因此大部分研究仍通过诱变育种来实现高产脂肪酶菌株的选育。乔红群等[35]利用紫外线与硫酸二乙酯复合的方式对一株根霉菌进行诱变，使其脂肪酶活提高52%。冀颐之等[36-37]分别采用原生质体激光诱变和低能N+注入技术对少根根霉进行诱变处理，得到的目的菌株酶活提高了165%。

2.2 少根根霉产脂肪酶发酵工艺研究

随着研究的进一步深入，研究人员对少根根霉产脂肪酶的发酵工艺进行了探究，以期得到少根根霉产酶的最佳条件，结合发酵条件优化，部分少根根霉菌发酵产脂肪酶情况如表2所示。

表2 少根根霉发酵产脂肪酶工艺研究

因为少根根霉菌丝发达，易缠绕成团，所以这会影响发酵结果，表2的研究证明了固定化菌体发酵能较好地解决少根根霉发酵过程中菌体缠绕和传质限制的问题，可有效促进菌体的生长和脂肪酶的合成。尹春华等[40]率先采用珍珠岩和聚氨酯泡沫作为根霉发酵产脂肪酶的固定化载体，使酶活提高了8倍。以此为基础，Yang等[43]以聚氨酯泡沫为固定化载体对固定化菌丝体分批次发酵进行了研究，结果发现，固定化菌丝体可在摇瓶中完成9批次产酶过程，在5 L发酵罐中成功实现6批次的产酶发酵，此法既提高了对菌丝体的利用效率又增加了脂肪酶的积累量，在未来的工业化生产中具有较大的开发潜力。

3 少根根霉产其他产物

除富马酸、脂肪酶外，少根根霉还可积累多种有机酸类、醇类及酶等产物，如乳酸、乙醇、纤溶酶及淀粉酶等[45-49]，其相关研究报道结果总结见表3。

表3 少根根霉产其他产物

因为少根根霉具有较广泛的产物种类，所以在利用少根根霉发酵产L-乳酸的研究中，乳酸产量和生产强度多在60～120 g/L和0.7～2.5 g/(L·h)，Fu等[50]利用一步发酵法将少根根霉的生长和产酸在同一培养基中进行，使其持续发酵直至耗糖结束，这与传统发酵法相比，菌体密度有所升高且乳酸产量也显著提高。另外，少根根霉是传统发酵中的可食用菌株，也是经FDA认证的安全菌，其糖化能力强，可将淀粉近乎理论值地转化为葡萄糖。同时，少根根霉是酒曲微生物的重要组成部分，具有较好的产乙醇能力，现根霉制曲已广泛应用于白酒、黄酒等发酵产品的生产[49]。随着人们对食品安全的逐步重视，少根根霉因其自身的安全性和可食用性在酿造行业具有良好的应用前景。

4 少根根霉菌丝体的综合利用

少根根霉不仅能用于生产多种产品，而且其菌丝体也具有重要的应用价值。由于少根根霉菌丝体含有丰富的多糖类物质及蛋白质，经加工处理后通常可作为替代成分添加到饲料中[51]，用于畜禽的养殖。除此之外，少根根霉的菌丝体也可作为废水中重金属离子及放射性元素的吸附剂、酶的固定化载体，还有用作生物质保温材料的潜力[52]。

原子能工业或其他工业产生的废水中往往含有放射性元素或重金属离子，为防止其对环境造成污染，需在排放前将其去除。少根根霉的菌丝体胞壁呈多层、微纤维结构，存在多个离子的吸附位点，且吸附能力强，可通过物理和化学吸附、静电作用、离子交换和络合等方式将重金属离子吸附到细胞表面“富集”起来，以降低废水中重金属离子的浓度[53]。菌丝体的吸附能力除受菌体量以及离子半径的影响外，受pH的影响较为明显，在不同pH条件下，菌丝体对各类重金属离子及放射性元素的吸附效率也会不同(表4)。在相同的pH条件下，菌丝体对不同物质的吸附率存在差异，可通过实验优化，调节反应体系至最佳pH时，其吸附率可大大提高。

表4 少根根霉菌丝体对废水中有害物质的吸附

少根根霉的菌丝体除用于吸附重金属离子及放射性元素外，还可作为脂肪酶的固定化载体。在生物柴油生产过程中，脂肪酶存在反应速率低、应用成本高、易失活等问题，但是来自不同真菌的菌丝结合酶是自然固定且非常稳定的，所以以菌丝体作为酶固定化的天然载体被认为是一种廉价的替代方法，用于脂肪酶在生物柴油和其他领域中，具有较大的开发潜力[58]。田娇娇[59]以少根根霉菌丝体为载体，经吸附和包埋相结合的固定化方法制备了一种核壳结构固定化酶，研究结果表明以其作为载体制备的固定化酶具有较好的稳定性和较高的使用效率。另外，少根根霉菌丝体在生长过程中能相互交联形成纤维网状结构，且其几丁质含量较高，具有较好的稳定性和阻燃性[60]，如将其与珍珠岩等其他材料复合，有用于制作生物质保温材料的潜力。综上，少根根霉菌丝体的应用不仅能实现对发酵废弃物的有效利用，降低生产成本，也可减小环境压力。随着研究的进一步推进，少根根霉菌丝体在其他领域的应用也将逐步得到开发。

5 展望

少根根霉具有环境适应能力强、营养要求简单、酶系丰富、可积累多种天然产物的优点，在食品、医药及化工等领域发挥越来越重要的作用，但目前仍然有几个技术难点阻碍了其产业化应用。首先，少根根霉形态发育机制不明，缺乏遗传操作工具，想要通过对菌株进行定向改造获得高产菌还有很大的困难，若能应用新型诱变技术——常压室温等离子体诱变等技术建立菌种选育方法，结合基因工程及组学的分析手段解析少根根霉细胞内基因的表达过程，剖析影响基因表达及其关键酶活性的因素，可获得稳定性好、活性高的少根根霉生产菌株。其次，少根根霉为无隔低等真核生物，其菌丝体不耐剪切，在发酵放大方面仍存在一定困难，若能将固定化技术应用到工业生产的发酵罐中，不仅能克服这一技术难点，还会在很大几率上降低生产成本。最后，少根根霉发酵生产过程仍存在产率低、分离纯化工艺繁琐等问题，与传统化学法相比仍缺乏竞争性，关于少根根霉发酵分离耦合的研究还需进一步推进，从而实现目标产物最大限度的积累，推动少根根霉发酵生产的产业化趋势。