三重real-time PCR同步检测黄牛、 水牛和牦牛成分

吴 姗，张明哲，方 云，陈 哲，张 荃，孙 超，沈旭芳，虞惠贞，尹文秀，张晓峰

（浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 310016）

在经济利益驱动下的肉制品制假贩假事件屡禁不绝，已成为中国食品质量控制面临的重要挑战之一。牛肉一直是制假掺假的重灾区，除了用价格相对低廉的猪肉、鸡肉、鸭肉冒充牛肉外，更有甚者将狐狸、水貂等肉掺入牛肉中进行销售。此外，由于牛肉本身可分为黄牛肉、水牛肉和牦牛肉，且这3 类肉之间也存在较大的价格差异，一般来说牦牛肉价格高于黄牛肉，黄牛肉又高于水牛肉，因此往往会出现水牛肉、黄牛肉被用来冒充牦牛肉，而水牛肉还被用来冒充黄牛肉。

近年来，国家针对肉制品掺假问题加强检测监管力度，大力支持肉品检测方法的研究。目前对肉类真伪鉴别的检测技术主要包括基于蛋白的免疫技术[1-2]，基于代谢物质的光谱技术[3-4]、电子鼻[5-6]、电子舌[7]技术，以及基于核酸的分子生物学技术等。由于DNA的生物学稳定性，不论是在生肉或是熟肉，或是在成分多样复杂的复合食品中，即便是在腐败变质的肉制品中，其物种特异性的DNA都能稳定存在，因此分子生物学的鉴定方法，仍是目前比较常用和可靠的鉴定方法。

早在1998年，为了防止疯牛病通过饲料传播，Tartaglia等[8]利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）在饲料中进行牛源性成分的检测。此后，在PCR基础上又衍生了PCR-限制性片段长度多 态性[9-10]和PCR-单链构象多态性分析[11]等技术。实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）的产生，免去了PCR技术后续凝胶电泳的步骤，同时能对整个PCR过程进行实时监测，因此该方法目前已成为一种较普及的用于肉制品真伪鉴别的方法[12-16]。目前用来鉴别牛肉真伪的real-time PCR方法已经较多，且建立一系列检测标准，如SN/T 2051—2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法》[17]，GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法》[18]、SN/T 2557—2010《畜肉食品中牛成分定性检测方法 实时荧光PCR法》[19]、 SB/T 10923—2012《肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法》[20]等，但上述标准并不能区分牛的种类。虽然目前也有有关黄牛[21]（参考冀德君等[22]和亐开心[23]等观点，黄牛包括普通牛（Bos taurus）和瘤牛（Bos indicus））、水牛（Bubalus bubalis）[21,24]和牦牛（Bos grunniens）[21,25]的检测方法，但上述方法存在灵敏度不高，或者覆盖度不高，即存在不能检测到种内某些品种的情况。

本研究研发具有黄牛、水牛和牦牛特异性的3 组引物探针，以实现用三重real-time PCR方法快速同步地对上述3 种牛肉制品进行真伪鉴别。以期为市场监管部门在实施相应监管措施时，提供详实可靠、可供参考的检测数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄牛、水牛和牦牛以及其他动植物样本购于市场或者本实验室保存，其中貉和银狐的样品采集自杭州动物园。动物样品取肌肉或骨骼、内脏和血液部分；植物样品取可食用部分。用于方法建立的黄牛、水牛和牦牛的样本真实性通过real-time PCR检测及测序确认[26-27]；其余肉类样本，包括绵羊、猪、马、驴、狗、鸡、鸭、鹅等的真实性通过相关检测标准（略）鉴定，其余样本通过外观确认。

实际的深加工样品中，如肉丸、肉松等，往往存在多种肉掺杂的情况。为了模拟检测混合样品，将黄牛、水牛和牦牛3 种肉干按照表1的质量比制成混合肉样，每个混合样总质量10 g，共制成9 个样（表1， 样品A～I）。混合样品经过振荡研磨仪混合研磨 （5 500 r/min，20 s，重复4～6 次）成肉泥，取充分混合的样品进行DNA提取。

表1 黄牛、水牛和牦牛混合肉样和混合DNA样品的制备Table 1 Preparation of mixed meat samples and mixed DNA samples from yellow cattle, buffalo and yak

Premix ExTaq大连TaKaRa公司；FF3750食品抽提试剂盒 美国Promega公司。

1.2 仪器与设备

Precellys Evolution振荡研磨仪 法国Bertin Technologies公司；NanoDrop ND-1000紫外-可见光分光光度计 美国Thermo Scientific公司；Lightcycle 480荧光定量PCR仪 德国Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA抽提

取动物肌肉、骨骼、内脏、血液或者植物可食用部分100 mg或100 μL，使用FF3750食品抽提试剂盒进行DNA提取，最后抽提得到DNA溶解在20～100 μL水中，使抽提得到的DNA质量浓度大于等于10 ng/μL。在单重、双重和三重real-time PCR体系灵敏度验证实验中，将黄牛、水牛和牦牛抽提得到的DNA质量浓度均调整为25 ng/μL，然后再进行4 倍梯度稀释。同时，还制备了3 种牛的DNA混合样，取质量浓度约为10 ng/μL，纯度A260nm/A280nm为1.7～1.9，3 种牛的DNA样品，按照表1体积比制成DNA混合样，每个混合样总体积为200 μL，共制成9 个样（表1，样品A′～I′）。DNA质量浓度和纯度用NanoDrop ND-1000紫外-可见光分光光度计在260 nm和280 nm波长处进行测定。

1.3.2 引物和探针的设计

基于黄牛、牦牛线粒体12S rRNA基因（序列号分别为KF926377.1和KJ463418.1）和水牛的线粒体Cyt b基因（序列号AY488491.1），根据引物设计原则，利用Primer Express软件设计了黄牛、水牛和牦牛特异性的引物探针3 组（表2）。

表2 检测黄牛、牦牛和水牛的引物和探针序列Table 2 Primers and probes used for the detection of yellow cattle-, buffalo- and yak-derived components

1.3.3 real-time PCR扩增检测

用于内参照引物探针的real-time PCR体系及反应条件见标准GB/T 25165—2010[18]。

用于3 种牛检测的单重real-time PCR反应体系如下：10 μL Premix ExTaq，上游引物（10 pmol/μL）0.4 μL，下游引物（10 pmol/μL）0.4 μL，探针（10 pmol/μL）0.4 μL，取上述DNA液1 μL，用水补足体积至20 μL。应用荧光定量PCR仪进行反应，反应程序为：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸23 s，40 个循环。

三重real-time PCR对黄牛、水牛和牦牛同步检测时，黄牛、水牛和牦牛探针的5′端分别用FAM、HEX和ROX标记，3′端则用Eclipse标记。三重real-time PCR体系如下：10 μL Premix ExTaq，各引物（10 pmol/μL）均0.13 μL，各探针（10 pmol/μL）均0.27 μL，取对应的DNA模板各1 μL，用水补足体积至20 μL。应用荧光定量PCR仪进行反应，反应程序为95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸23 s，40 个循环。

FAM、ROX、HEX三重荧光补偿。荧光补偿反应程序参照Roche说明书：1）95 ℃预变性10 s；2）95 ℃变性5 s；60 ℃退火延伸23 s；40 个循环；3）95 ℃变性10 s；40 ℃退火30 s；95 ℃变性；40 ℃，1 s。补偿反应时进行单重real-time PCR，体系如下：10 μL Premix ExTaq，上游、下游引物（10 pmol/μL）各0.4 μL，探针 （10 pmol/μL）0.8 μL，取DNA 1 μL，用水补足体积至20 μL。在三重real-time PCR结束后调用该荧光补偿程序，进行荧光补偿，对补偿后的数据进行判断，确保无荧光干扰而产生的假阳性。

real-time PCR检测中，Ct值表示每个反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个实验重复 3 次，Ct值为3 次结果的平均值，并计算标准差。

1.3.4 标准曲线绘制

为确定单重real-time PCR检测体系的检出限和线性范围，对目标DNA进行梯度稀释，并利用DNA浓度和Ct值之间的相关性绘制标准曲线。将抽提得到的DNA进行4 倍梯度稀释，进行real-time PCR检测。变量相关性 公式[28]：Ct =blgCDNA+a（b为斜率，a为截距）。

2 结果与分析

2.1 引物探针的特异性

将设计得到的用于检测3 种牛的引物探针用于检测包括黄牛、水牛和牦牛在内的19 种家畜、家禽及其他动植物。结果显示上述引物探针只对目标物种呈阳性反应，其他非目标物种均未检测到Ct值（表3）；而同时用检测真核生物的引物探针检测时，反应都呈阳性，说明抽提得到的DNA质量符合real-time PCR检测要求。在单重real-time PCR检测体系中，以单一的目标DNA为检测样本，设计得到的引物探针序列有较好的特异性。

表3 黄牛、水牛和牦牛引物探针的特异性Table 3 Specificity of the primers and probes for the detection of yellow cattle-, buffalo- and yak-derived components

2.2 单重real-time PCR的检测灵敏度

将3 种牛DNA质量浓度都调节到25 ng/μL左右，再进行4 倍稀释，共形成8 个质量浓度梯度。各个DNA质量浓度单重real-time PCR的结果如表4所示，当3 种DNA质量浓度稀释到0.025 ng/μL时，3 种牛的检测都能得到Ct值小于35且阳性明显的S型扩增曲线，此时得到3 组标准曲线的R2值均大于0.99（黄牛：y=－4.270 3x+26.524，R2=0.992 3；水牛：y=－4.281 1x+27.028，R2=0.995 8；牦牛：y=－4.376 4x+24.514，R2=0.997 7）；但进一步稀释后（质量浓度至0.006 ng/μL），黄牛和牦牛得到的Ct值分别为38.4和38.8，而水牛则无Ct值显示，此时黄牛和牦牛的标准曲线的R2值分别降至0.982 6 （y=－4.683 7x+26.691）和0.959 7（y=－5.166 2x+24.833）；DNA质量浓度降至0.002 ng/μL左右时，则3 种牛的检测结果都呈阴性。R2值大于0.99时，说明该标准曲线所取范围内的DNA质量浓度与Ct值有较好的对应关系，Ct值能比较准确地反映对应DNA的浓度；R2值下降，说明两者间的对应关系下降，Ct值反应对应DNA质量浓度的可信度下降。

表4 单重real-time PCR检测黄牛、水牛和牦牛的灵敏度Table 4 Sensitivity of simplex real-time PCR for the detection of yellow cattle-, buffalo- and yak-derived components

因此，为方便统计，在后续3 种牛的双重及三重real-time PCR检测中，以35为Ct值的临界值，3 次检测结果中2 次或2 次以上Ct值小于35，结果为阳性（+）；2 次或2 次以上Ct值大于等于35或无Ct值显示，结果为 阴性（－）。

2.3 双重和三重real-time PCR的检测灵敏度

在双重real-time PCR的检测中，将任意2 种引物探针组合按照1∶1比例混合，得到结果显示：只有黄牛的检测因为试剂间及2 种DNA间的叠加而导致其灵敏度降低至0.1 ng/μL， 而水牛和牦牛的检测灵敏度仍保持在与单重real-time PCR的水平（0.025 ng/μL）一样，并未下降（表5）。

表5 双重和三重real-time PCR同步检测黄牛、水牛及牦牛Table 5 Simultaneous detection of yellow cattle-, buffalo- and yakderived components by duplex and triplex real-time PCR

但双重变成三重real-time PCR后，结果则大不相同，即便是在最高的起始质量浓度下（25 ng/μL），黄牛和水牛的检测都未得到阳性结果，但牦牛的检测灵敏度仍然保持在0.025 ng/μL，未受到三重的影响。为了提高三重real-time PCR检测中黄牛和水牛的检测灵敏度，调整3 种引物探针组合的浓度比例。比较8 种混合比例，提高黄牛和水牛的引物探针比例有助于提高检测灵敏度，表6显示，当黄牛、水牛、牦牛3 组引物探针的比例调节为3∶3∶2时，黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1 ng/μL，而牦牛的灵敏度仍可达到0.025 ng/μL，因此认为该比例较佳。

表6 黄牛、水牛和牦牛三重real-time PCR检测体系优化Table 6 Optimization of triplex real-time PCR systems for cattle-, buffalo- and yak-derived components

杨冬燕等[29]利用多重real-time PCR同时对猪、牛、马和鸭进行同步检测，在进行多重real-time PCR同步检测前，先对单重real-time PCR的检测方法进行优化，在优化后的单重反应体系中直接增加对应的引物和探针，即可用于多重real-time PCR的检测，而无需对多重realtime PCR体系进行调整也能得到较好的结果。但本研究团队在对家蚕3 种疫病病原体进行real-time PCR同步检测[30]时也发现，最佳的单重检测体系在应用到双重和多重real-time PCR时需要对体系进行调整，特别是通过不同引物探针组合间比例的调整，能达到最佳的同步检测效果。许如苏等[31]利用锁核酸探针（TaqMan-LNA）多重real-time PCR对牛、猪、鸡、鸭等成分进行同步检测，也认为通过对不同引物探针浓度比例的调整，可以得到比较好的检测结果，如上述对应物种的最佳引物终浓度比为6∶6∶3∶8，最佳探针终浓度比分别为3∶3∶1∶4；同时也发现，多重real-time PCR灵敏度会较单重低1 个数量级。

2.4 混合样中real-time PCR的检测

对制成的混合肉样用单重、双重和三重real-time PCR进行检测（表7）。单重real-time PCR结果与预设结果一致；在进行黄牛与牦牛的双重real-time PCR时，样品G（黄牛∶水牛∶牦牛=8∶1∶1）中出现了牦牛检测的假阴性；在三重real-time PCR的检测中，不论引物探针比例（黄牛∶水牛∶牦牛）为3∶3∶2或是2∶2∶1，都未在样 品G中检测到牦牛而产生假阴性，此外，样品C（黄牛∶牦牛=9∶1），在引物探针比例为3∶3∶2（黄牛∶水牛∶牦牛）的三重real-time PCR的检测中，也出现了牦牛检测的假阴性。在对混合样的检测中，所有的检测不符合的情况都出现在双重或者三重real-time PCR中的牦牛检测中，且都是假阴性。样品C和G在进行单重real-time PCR检测时，牦牛的检测结果都呈阳性，说明后续双重和三重real-time PCR检测的阴性并非样品混样不匀造成。

表7 混合肉样的real-time PCR检测结果Table 7 Real-time PCR results for mixed meat samples

同时也对混合的DNA样品进行了单重、双重和三重real-time PCR的检测（表8）。虽然DNA混合的比例和肉样混合的比例一致，但两组样品的检测结果却并不一致。在混合的DNA样品中，也出现了假阴性的结果，但都出现在黄牛的检测中：样品D’（黄牛∶牦牛=1∶9）和I′（黄牛∶水牛∶牦牛=1∶1∶8）在双重及三重real-time PCR中，都没有检测到黄牛的DNA；样品H’（黄牛∶水牛∶牦牛=1∶8∶1）的检测中，也未能在三重real-time PCR中检测到黄牛。在DNA混合样中（表8），3 种牛的DNA质量浓度均选用了10 ng/μL，将DNA质量浓度都调整为25 ng/μL，再按照表1体积比对3 种DNA进行混合，得到的结果和表8略有不同：此浓度下只有样品D’（黄牛∶牦牛=1∶9）存在检测的假阴性，即在双重和三重realtime PCR检测中都未检测到黄牛DNA，而其余样品的检测结果均与设置一致。

表8 混合DNA的real-time PCR检测结果Table 8 Real-time PCR results for mixed DNA samples

表6中得到的最佳引物探针比例是在3 种牛的DNA含量为1∶1∶1的情况下得到的，但当三者的比例存在大幅度差异的时候，特别是黄牛和牦牛的含量差异较大时，如表7中的样品C和G，表8中的样品D′和I′，含量低的物种很可能会出现假阴性的现象。但水牛的检测，并没有因为含量低至10%而出现假阴性。黄牛和牦牛都属于牛属（Bos），种属间的亲缘关系近，相比较水牛属于水牛属（Bubalus），与黄牛、牦牛的种源关系较远。在同步的多重real-time PCR检测中，若检测的目标物种种属关系亲密，同时样品为复合样品，即几种种属关系亲密的物种同时存在于一个样品中，且含量差异较大，则量少的物种可能会存在检测的假阴性。本研究没有通过调节各组引物探针的比例去克服假阴性，因为在实际检测的样品中，无法预知各种牛成分含量的比例。

杨冬燕等[29]也对混合肉样进行了三重real-time PCR同步检测，对猪、牛、马和鸭4 种成分的检出限在5%～15%之间，且检测过程中并没有出现假阴性的结果。猪、牛、马和鸭，4 种物种间的种属关系较远，可能是该三重real-time PCR成功同步检测的重要前提。

3 结 论

本研究基于具有物种特异性的线粒体基因，设计可鉴定黄牛、水牛和牦牛的引物探针各1 组，并在3 个探针上分别标记了不同的荧光信号，在优化三重real-time PCR的条件下，实现同步检测黄牛、水牛和牦牛成分。但由于三重real-time PCR对混合样中含量较低的黄牛和牦牛的检测存在假阴性的可能，因此，建议在对整块肉的样品进行检测时采用三重real-time PCR的方法同步检测3 种牛的成分，若样品为混合物，如肉丸、肉松等，则用单重real-time PCR检测更精准。