纳米多孔金电化学传感器构建及其对饮品中 抗坏血酸的检测

张巧云，程玮玮，张 岩，杨文建，杨玉玲，汤晓智,

（1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及 深加工重点实验室，江苏 南京 210023；2.河北省食品检验研究院，河北 石家庄 050091）

抗坏血酸，又称VC，是人体必需的一种水溶性维生素，广泛存在于新鲜水果和绿叶蔬菜中，尤其是蕃茄、橙、橘、鲜枣和辣椒中含量最多[1]。它是人体必需的营养素之一，是人体生命活动中酶辅因子和酶的重要组成部分[2]。VC广泛参与机体氧化、还原等复杂代谢过程，能促进体内胶原蛋白和多糖的合成，增加机体抵抗力，延缓衰老，预防坏血病及癌症[3]。在人体内的新陈代谢过程中，VC可调节机体代谢，增加机体抵抗力；它在人体内的协同作用，可以有效提高人体对铁的吸收率，从而促进外伤愈合[4]。但是，由于机体内缺少合成VC必需的古洛糖内酯氧化酶，人体自身不能合成VC，须从食物中获取，所以食品中VC也是食品贮藏、加工过程中的一项重要营养指标。VC每日推荐摄入量为70～90 mg，每日的安全剂量应少于1 000 mg，过量摄入时也会引起胃酸、腹泻及尿酸结石及皮疹等不良反应[5]。在食品加工中，VC常作为一种营养强化剂被添加到饮料、肉制品及保健品中。同时，由于其具有强还原性，还可作为抗氧化剂使用，对食品起到一定的保鲜作用。鉴于VC在食品中的广泛应用，人们对其含量的定量检测一直非常重视。但是，由于VC易被空气中的氧气氧化，且易受温度、金属离子、pH值、酶、食品的加工贮存方式等影响，导致许多VC检测方法的测定并不精确。在实际检测中，如何对抗坏血酸快速、精确定量是目前面临的一项重要挑战[6]。

目前，VC测定方法主要有高效液相色谱法、超高液相色谱-串联质谱法、电化学法、光谱法、动力学光度法、荧光法等[7-15]。但是由于光谱法、色谱法及质谱法等几种分析方法存在仪器价格高、光路复杂、运行费用高、不易携带等缺点，不适用于现场检测。在实际样品检测中，VC遇氧、热、光、碱性物质，特别是在有氧化酶及痕量铜等金属离子存在时，易被氧化成为脱氢型VC，所以复杂的前处理过程会对检测结果的准确性造成严重影响。电化学检测作为一种快检技术，近几年来，其应用的领域正在不断扩大，除了在生物医药、环境监测等领域，在食品安全检测上的运用也越来越广泛。电化学分析法具有良好的选择性、轻便的仪器设备和快速的分析速度，对于一些样品，甚至不需要前处理过程。利用一些化学物质、生物材料修饰电极，通过构建的电化学传感器将化学信号转变为电信号，能检测到特定目标物质，方法简便、重复性强，适合现场快速检测。近几年，由于纳米材料的兴起，采用纳米材料修饰或聚合物复合碳纳米材料修饰电极测定VC的研究时有报 道[16-20]。但是，多种材料复合修饰，电极的制备过程往往较为繁琐，导致电极制备存在严重的批次间差异，这也限制了它们在实际检测中的广泛运用。

纳米多孔金（nanoporous gold，NPG）作为一种纳米材料，易于制造，具有高电化学催化作用、高比表面积、出色的化学稳定性，因此在电化学领域及各类传感器中应用广泛[21]。其独特的三维网状结构和纳米级孔隙率增加了比表面积，有利于吸附更多的检测目标物并对其进行高灵敏度检测[22]。

本研究采用NPG修饰玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE），成功构建NPG电化学传感器，可对VC进行快速检测。本研究结果有望为实现饮料中VC的快速精确检测提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水溶C100饮品、农夫果园果汁 南京市苏果超市购。

VC标准品（L-VC，纯度（99.9±0.5）%） 上海 源叶生物科技有限公司；偏磷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、硝酸（质量分数约为65%）（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；5%的Nafion溶液 昆山桑莱特新能源科技有限公司； 实验所用其他试剂均为分析纯。

磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH 7.0）：称取适量磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合配制而成；柠檬酸缓冲液（50 mmol/L，pH 7.0）：称取柠檬酸和柠檬酸钠混合配制而成；0.5 mol/L H2SO4溶液：将13.587 mL浓H2SO4稀释于500 mL超纯水中配制而成；12 K Au/Ag金箔（Au50%、Ag50%） 美国Sepp Gilding Workshop公司；氧化铝粉（50 nm） 上海辰华仪器公司；高纯氮气（纯度＞99.9%）；0.5% Nafion溶液：称取1 g 5%的Nafion溶液于9 g无水乙醇中配制而成；实验中清洗、配制溶液等均使用超纯水：电阻率≥18 MΩ•cm。

1.2 仪器与设备

电极反应池由山东大学化学院玻璃仪器制造室订制；GCE（直径5 mm）、Pt片电极（长×宽1 cm×1 cm）、CHI 150饱和甘汞电极（saturated calomel electrode，SCE） 天津艾达恒晟科技发展有限公司；CHI 760D电化学工作站 上海辰华仪器公司；ISO 9001电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司； 红外干燥箱 南京科尔仪器设备有限公司；PHS-25雷磁 pH计 上海力辰仪器科技有限公司；场发射扫描电子显微镜 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 NPG的制备

NPG的腐蚀：采用去合金法[23]，通过浓硝酸腐蚀12 K Au/Ag金箔可制得NPG。首先将合金箔裁剪成0.8 cm×0.8 cm大小，并转移到已预热10 min的浓硝酸中，30 ℃水浴30 min；水浴后捞出金箔转移到超纯水中，静置10 min；将金箔转移至另一杯超纯水中静置30 min；重复该步骤，直至移出金箔的超纯水pH值呈中性[24-26]，浮纯水中的金色薄膜即NPG。

1.3.2 NPG电化学传感器的构建

GCE的清洗：少量氧化铝粉（0.05 μm）置于麂皮上，将GCE抛光至镜面，冲洗干净后在超纯水中超声清洗10 min，彻底洗去氧化铝粉后，在50%硝酸溶液中超声清洗5 min。再用无水乙醇、超纯水交替超声3 min，超纯水冲洗干净后，自然晾干电极表面。然后，在电极表面滴加5 μL 0.5% Nafion溶液，防尘橱中自然晾干后电极表面形成一层Nafion膜；再将电极浸入水中，将漂浮在水中的NPG平贴在电极表面，取出擦除电极上的水珠和玻碳周边多余的金渍；最后，在镜片边缘滴加Nafion覆盖金箔，防尘橱中自然晾干后，红外干燥10 min，即制得NPG/GCE，将制备好的NPG/GCE放入防尘橱中备用。

1.3.3 NPG电化学传感器的表征

为表征NPG的表观形貌，将超纯水中的NPG贴附在导电胶上红外干燥10 min，置于S-4800扫描电子显微镜下观察。考虑到NPG是由金银合金箔经硝酸腐蚀制成，因此，银元素残留会大大影响多孔金的结构及电极性质。为评估NPG的化学纯度并评估是否存在其他污染物，同时对其EDS能谱进行扫描。

1.3.4 NPG电化学传感器的活化及电化学测试

裸GCE的电子转移速率较低，电化学性能较差，通过电化学方法对电极进行活化[27-28]，能激活电极表面NPG性能，提升电荷传递能力，从而充分发挥NPG/GCE的功效。将制备好的NPG/GCE转移到15 mL 0.5 mol/L H2SO4中用循环伏安（cyclic voltammetry，CV）法扫描，使NPG初步活化；然后，将NPG/GCE用超纯水洗去H2SO4，转移到磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH 7.0）中，再次进行CV扫描，这不仅清洗了电极表面，而且使NPG/GCE得到进一步活化。

以还原峰峰电流表征NPG/GCE的有效面积 （s/cm2＝Ah/C×2 500，其中，Ah为电荷量）和电流密度j=i/s（i为峰电流值）。实验中所有电化学反应均利用传统三电极体系在室温（约25 ℃）进行，以NPG/GCE作为工作电极，表面积2 cm2的Pt片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。在所有实验前的15 min向体系内通高纯氮气以除去溶液中的氧气，实验过程中持续通入氮气，排除氧气防止VC被氧化。使用CHI 760E电化学工作站进行测试，工作原理如图1所示，所有电位均相对于SCE。

图1 工作原理Fig. 1 Schematic diagram of the working principle of the NPG-based electrochemical sensor

1.3.5 VC的电化学检测

准确称取5 mg VC标准品，配制成5 mg/mL VC母液，通过向含有15 mL柠檬酸缓冲液的电解池中加入不同体积的母液，利用差分脉冲伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法，得到不同的峰电流值，以VC质量浓度为横坐标，峰电流值为纵坐标，建立标准曲线。

1.3.6 样品处理

选取水溶C100和农夫果园果汁2 种饮料，准确移取20 μL，将其稀释100 倍后经过0.45 nm过滤得到滤液，取500 μL样品滤液于电解池中，测定样品的VC峰电流值。每个样品重复测定3 次取平均值。

2 结果与分析

2.1 NPG的表征

由图2a、b可以清晰看到，NPG表面有密集的孔洞，这是Au/Ag金箔中的Ag被硝酸腐蚀后留下的纳米孔洞；由NPG的EDS能谱图（图2c）可见，在2.12 keV出现明显的Au强度值，表明富含Au元素；同时，含有少量O和C元素，没有出现明显的Ag元素，证明合金中的Ag被腐蚀完全，制得的NPG具有高纯度。

图2 NPG的形貌表征Fig. 2 Morphological characterization of NPG

2.2 电化学检测条件优化

2.2.1 缓冲液的优化

NPG具有强催化性能和强吸附作用，结合VC的氧化机理（C6H8O6－2H+→C6H6O6+2e）可知，在实验中，VC分子均匀分散于NPG中，再经过NPG催化，羟基基团上的氢被氧化，产生了2 个电子。因此，NPG活性对VC有一定的影响。利用CV法，在扫描速率为50 mV/s条件下，研究NPG的电极在不同缓冲溶液（50 mmol/L）中的电化学活性。如图3所示，在相同pH值条件下，不同缓冲液中氧化还原峰的位置基本不变，对比峰高，可以明显看到在柠檬酸缓冲液中（50 mmol/L、pH 6.0），NPG/GCE的氧化还原峰电流密度明显高于磷酸缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，表明在柠檬酸缓冲液中，NPG的催化性能被激活到最大，有利于进一步催化VC产生电子。因此，后面选用柠檬酸缓冲液体系作为VC的检测环境。

图3 NPG/GCE在3 种不同缓冲液中的CV图（pH 6.0）Fig. 3 Cyclic voltammograms (pH 6.0) of NPG/GCE in three different buffers

2.2.2 pH值条件的优化

对于同一种缓冲液，电解液的pH值可能会对电极表面的动力学以及电荷转移有很大影响。有文献[29]报道：由于H+参与了VC的氧化过程，所以随着pH值的变化，VC的氧化峰电位会发生偏移且峰电流呈减小趋势。因此，电解液的最适pH值也是电化学分析技术的重要参数。由于VC在碱性条件下更容易氧化分解，所以选用偏酸性的pH 3.0～6.0的柠檬酸缓冲液对VC检测条件进行优化。

为更好地实现对VC的高灵敏度检测，分别考察构建的NPG/GCE在不同pH值条件下（3.0～6.0）对同一质量浓度的VC（160 μg/mL）的电化学响应，对电解液的最适pH值进行优化。如图4所示，随着缓冲液pH值的升高，NPG对VC的电化学催化氧化的峰电流密度先升高后降低，且伴随着出峰电位的变化。当pH值为4.0时，电极对VC催化所产生的峰电流密度达到最高，即获得高峰值电流响应；在较低pH值和较高pH值条件下，氧化还原峰电位分别朝着正方向和负方向移动；pH值大于4.0时，VC的峰值电流之所以随着pH值的增加而降低，可能是由于较高pH值下VC的分解所致，这些现象表明pH 4.0的柠檬酸缓冲液体系更加有利于VC的氧化。因此，在该工作中选择pH 4.0的柠檬酸缓冲液对目标分析物VC进行进一步研究。

图4 NPG/GCE在不同pH值含160 μg/mL VC柠檬酸缓冲液中的DPV曲线Fig. 4 DPV curves of NPG/GCE in CBS buffer containing 160 μg/mL VC at different pH

根据前人的研究[30-32]和实验探索，对VC电化学检测的分析方法进行优化，结果表明相比较于CV法、线性扫描伏安法、方波伏安法等分析方法，在同一VC质量浓度下，采用DPV法出峰更加明显，能更好地实现VC的灵敏性检测。因此，本研究采用DPV法，在柠檬酸缓冲体系下，对不同质量浓度下的VC标准品进行检测，通过相关性分析建立模型，并将其用于饮料中VC含量的快速测定。

2.2.3 反应类型的判断

NPG/GCE在除去氧气的柠檬酸缓冲液（50 mmol/L， pH 4.0）中进行扫描速率实验，如图5所示，在不同的扫描速率下，发现电流密度的大小取决于扫描速率。对扫描速率的1/2次方与峰电流密度进行拟合，在20～200 mV/s的范围内，扫描速率的1/2次方与峰电流密度呈线性关系，线性方程为j=16.406 1v1/2－2.445 1，R2=0.997 7。阴极电流密度和阳极峰电流密度之比 接近1。这些典型特征与文献[33-35]的扫描速率实验结果吻合，证实在本实验中，电子在NPG电极表面转移的过程是扩散控制的过程。

图5 不同扫描速率下，NPG/GCE在含160 μg/mL VC柠檬酸缓冲液（50 mmol/L，pH 4.0）中的CV曲线Fig. 5 CV curves of NPG/GCE in CBS buffer (50 mmol/L, pH 4.0) containing 160 μg/mL ascorbic acid at different scanning rates

2.2.4 NPG电极的重复性及贮存稳定性

由于电极的使用次数及保存时间会影响电化学峰电流的测定。在实际检测中，为保证实验的准确性，需要对修饰电极的重复性和稳定性进行考察。在含有一定质量浓度VC标准液的反应体系中进行4 次连续测试，对修饰多孔金电极的重复性进行研究，经计算4 次测试相应峰电流密度，得到相对标准偏差为2.47%，说明电极几乎不会被污染，有良好的重复性。

在最佳条件下（pH 4.0柠檬酸缓冲液中），通过DPV法对所制备的电化学传感器的贮存稳定性进行研究。NPG/GCE存于超纯水中，于4 ℃贮存1 个月，连续4 周观察电极在含有100 μg/mL VC柠檬酸缓冲液中的响应电流密度变化。如图6所示，前4 周响应电流变化不大，表明电极有较长的使用寿命和稳定性。在10 周后观察到电流响应有一定损失，这可以归因于贮存时间过长，NPG表面的缓慢氧化，该变化抑制了VC电子转移过程，从而导致VC氧化峰电流明显下降。

图6 NPG/GCE贮存稳定性检测的DPV图Fig. 6 DPV curves of storage stability test of NPG/GCE

2.2.5 NPG/GCE对VC的检测

VC具有电催化活性，利用DPV法对不同质量浓度VC进行电催化，并观察电流响应。由图7可知，NPG/GCE对VC的检测，在0.1 V处产生明显的（氧化）峰电流变化，且在6.652 8～160 μg/mL的范围内，峰电流密度j（μA/cm2）与VC质量浓度CVC（μg/mL）呈线性关系。线性回归方程为j＝0.765 26CVC+27.899 27，R2＝0.994。

图7 NPG/GCE在含不同质量浓度VC柠檬酸缓冲液（50 mmol/L， pH 4.0）中的DPV曲线 Fig. 7 DPV curves of NPG/GCE in CBS buffer solution (50 mmol/L, pH 4.0) containing ascorbic acid at different concentrations

2.2.6 NPG/GCE的抗干扰能力测试

食品基质相对较复杂，在实际检测中，电极的抗干扰能力尤为重要。根据前人[36-39]在电极抗干扰能力研究上的相关经验，以158 μg/mL的VC标准样品为试样，选取饮料配料中常见的葡萄糖、柠檬酸和一些食品添加剂为干扰物质，考察NPG/GCE的抗干扰能力。将 2 252 μg/mL葡萄糖、288 μg/mL柠檬酸、588 μg/mL柠檬酸钠、230 μg/mL羧甲基纤维素钠、0.36 μg/mL胭脂红分别加入到含有900 μmol/L VC的柠檬酸缓冲液（pH 4.0）中，观察了DPV的峰电流密度随定量添加干扰物后的变化行为。如图8所示，这些饮料中的成分被加入到反应体系中后，NPG电极检测VC的峰电位和峰电流密度均无明显变化。其中，VC的峰电流密度变化率均小于3.7%。因此，构建的NPG电极在检测VC时，对饮料中常见组分具有较好的抗干扰能力。

图8 饮料中常见干扰物质对NPG/GCE检测VC的影响Fig. 8 Effects of common interfering substances on VC detection by NPG/GCE in beverages

2.2.7 NPG/GCE对实际样品VC的测试

采用加标回收法对电极的实用性能进行评估，利用NPG/GCE对水溶C100和农夫果园两种饮料中的VC质量浓度进行检测。为确保实验的准确性，在pH 4.0柠檬酸缓冲液中加入450 μL样品的同时加入一定质量浓度的VC，将NPG/GCE检测得到的数值代入相应拟合曲线（j=0.765 26CVC+ 27.899 2）计算加入样品中VC质量浓度，结果如表1所示，结果表明VC回收率在94%～109%之间。基于以上结果，证实利用NPG/GCE可以有效地对实际样品中VC进行检测，检测结果具有可靠性。同时将电化学检测结果与高效液相色谱法进行比较，结果如表2所示，2 种测定方法的结果具有较好的一致性，结果令人满意，证明该NPG传感器具有很好的实用性。

表1 饮料中VC的测定结果Table 1 Recoveries of VC in spiked beverages

表2 不同检测方法对水溶C100中VC含量测定结果的对比Table 2 Comparison of HPLC and electronchemistrical methods for detection of VC content in water-soluble C100

3 结 论

本实验利用腐蚀法制备NPG，并将其应用于构建一种基于NPG的电化学传感器，用于饮料样品中VC的快速检测。NPG独特的三维网状结构，使修饰电极对VC具有较强的吸附性和良好的电催化能力，提高了VC响应电流的能力，可用于VC的定量检测。在一定质量浓度范围的VC溶液中，峰值电流与扫描速率呈线性关系，说明NPG对VC的电催化受吸附效应控制。当VC质量浓度介于6.652 8～160 μg/mL时，其氧化峰电流密度与质量浓度具有良好的线性关系。该检测方法电极制备简单，无需对样品进行复杂前处理，有效避免了VC的氧化，检测结果更加准确，检测更加迅速。小型检测设备便于携带，可以满足食品质检中对样品现场快速检测的需求。