UPLC-MS/MS检测肉制品中16 种杂环胺 前处理方法筛选

丁晓倩，惠 腾，白 雪，王振宇，张德权

（中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193）

高温是肉制品加工的主要手段之一，有助于有益物质的形成，提高肉品风味和营养品质，但是也会产生一系列的致癌、致突变化合物——杂环胺（heterocyclic amines，HAs）[1-2]。HAs是一类具有杂环结构的聚类化合物，除1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（1-methyl-9Hpyrido[3,4-b]indole，Harman）、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（9H-pyrido[3,4-b]indole，Norharman）和3,4-环戊烯吡啶并[3,2-a]咔唑（3,4-cyclopentenopyrido[3,2-a]carbazole，Lys-P-1）外，其余HAs的杂环结构均由2～5 个含氮芳香环组成[3]。HAs在代谢过程中环外氨基经酶催化形成N-羟基衍生物，并能进一步与DNA共价结合形成加合物，使细胞突变为肿瘤细胞[4]，最常见的有结肠癌、肝癌、口腔癌、造血系统癌、乳腺癌和淋巴系统癌等[5-6]。根据生成条件及化学结构的不同，可将HAs分为两类：第1类由葡萄糖、氨基酸、肌酸/肌酸酐在150～200 ℃经Maillard反应产生，称为氨基咪唑氮杂芳烃类（aminoimidazoleazaarenes，AIAs），根据化学结构的差异，AIAs类HAs又可分为喹啉类（2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉（2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline，IQ））、喹喔类（2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，MeIQx）、 2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,4,8-trimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，4,8-DiMeIQx）、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,7,8-trimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，7,8-DiMeIQx））、吡啶类（2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine，PhIP）；第2类由氨基酸或蛋白质在250 ℃以上的高温条件下，如由色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、鸟氨酸及酪蛋白或大豆蛋白热解产生[7]，称为氨基咔啉，包括α-咔琳（2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole，AαC）、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole，MeAαC））、β-咔啉（Norharman、Harman）、γ-咔啉（3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚（3-amino-1,4-dimethyl-5Hpyrido[4,3-b]indole，Trp-P-1）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶[4,3-b]吲哚（3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole，Trp-P-2））和ζ-咔啉（2-氨基-6-甲基二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d]咪唑（2-amino-6-methyldipyrido[1,2-a:3’,2’-d]imidazole，Glu-P-1）、2-氨基-二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d]咪唑（2-aminodipyrido[1,2-a:3’,2’-d]imidazole，Glu-P-2））[2,8]。人类接触HAs的方式多是经由饮食摄入，流行病学研究表明，长期食用HAs含量较高的肉制品与患不同癌症之间有直接的相关性[9-10]，然而不同食物之间HAs含量有很大差异性。例如，在不同的烹饪条件下，猪肉中PhIP的含量范围为1～320 ng/g， 而7,8-DiMeIQx的含量低于0.1 ng/g[11]。Oz等[12]发现鹅肉中HAs的含量也有所差异，含量最多的是IQ，其次是MeAαC、MeIQ和7,8-DiMeIQx，然而IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx和AαC的含量低于1 ng/g。最近有研究表明，人体摄入PhIP、DiMeIQx与患结直肠癌的风险呈正比[13]。因此精确量化各种肉制品中HAs的含量尤为重要。

肉制品中HAs的含量单位仅为ng/g[14]。因此，有效、简单的样品制备程序将大大提高仪器分析的准确性，可以通过液液萃取、固相萃取（solid phase extraction，SPE）、超临界流体萃取、加压溶剂萃取微波辅助萃取等方法实现[15]。最常用的是SPE法，目前为止，已经报道了几种改进的SPE法。Gross[16]发明了一种固相串联法（Extrelut-PRS-C18），提高了净化效果。这一过程通常是用NaOH溶液对样品进行均质，然后，用二氯甲烷从碱化的样品中提取HAs，接着用串联固相萃取小柱（Extrelut、丙基磺酸阳离子固相萃取柱和C18小柱）对目标分析物进行纯化。作为一种传统的方法，该方法近年来已经被大量研究报道，然而该方法耗时较长，在实际应用中并不方便。随后研究者发明了更方便、更易于使用的方法。使用Oasis MCX固相萃取柱代替PRS和C18固相萃取柱，MCX固相萃取柱中的混合模式材料中含有共聚物和硅胶颗粒，这些物质具有疏水和离子相互交换作用，能够实现一步从样品中提取HAs。近年来，QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe）法也作为一种快速、简便、便宜、有效且安全的提取方法用于高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）-二极管阵列检测或HPLC-电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）-质谱（mass spectrometry，MS）测定肉制品中的HAs[17-20]。

LC-MS/MS具有选择性高、灵敏度高、无需衍生化处理等优点，被证实是一种较理想的分析方法[21]，能够实现肉类中痕量HAs的测定。因此本实验以超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测方法为基础，比较分析串联固相萃取法（Extrelut-PRS-C18、PRS-C18固相萃取柱萃取法）、MCX固相萃取柱萃取法以及分散固相萃取法（QuEChERS）3 类4 种方法对肉制品中HAs提取效果的影响，以此为基础建立一种高效、安全、经济的肉制品中HAs的UPLCMS/MS检测方法，以期为后续肉制品中HAs提取检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6 只小尾寒羊与蒙古羊杂交的二寒羊公羊前腿，购自内蒙古巴彦淖尔草原宏宝公司，二寒羊公羊来自于集中饲养，屠宰平均月龄5 个月，体质量30 kg左右。在（6.0±2.0）℃、相对湿度（95±5）%条件下排酸24 h，羊前腿肉半膜肌pH 6.2±0.3。4 ℃条件下立即将上述6 条羊前腿去皮去骨修掉可见的结缔组织，收集肌肉组织贮存于－30 ℃备用。

16 种HAs标准品：PhIP、IQ、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoxaline，IQx）、2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉（2-amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]quinoline，MeIQ）、MeIQx、7,8-DiMeIQx、4,8-DiMeIQx、2-氨基-4,7,8-三甲基咪唑并[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-4,7,8-trimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，4,7,8-TriMeIQx）、AαC、MeAαC、Glu-P-1、Glu-P-2、Trp-P-1、Trp-P-2、Harman和Norharman（每种化合物纯度均大于99%） 加拿大TRC公司；甲醇、乙腈（均为色谱级） 美国 赛默飞世尔公司；冰乙酸、乙酸铵（均为色谱级） 上海麦克林生化科技有限公司；盐酸、乙酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；Bond Elut C18固相萃取柱（500 mg/3 mL）、Bond Elut PRS固相萃取柱（500 mg/3 mL）、Bond Elut QuEChERS萃取包、Bond Elut QuEChERS dSPE试剂盒 美国安捷伦公司；Extrelut NT20空柱（PE柱，20 mL）及填充料硅藻土 德国Merck公司；Oasis MCX 3 mL Vac Cartridge, 60 mg Sorbent per Cartridge, 30 μm Particle Size 美国Waters 公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

6470 LC/TQ LC-MS/MS仪 美国安捷伦公司；ML204-02电子天平 上海梅特勒-托利多有限公司；Testo 205 pH计 德国德图公司；CR22G II高速冷冻离心机 日本日立公司；TTL-DCII氮吹仪 北京同泰科技有限公司；Ultra Turrax Disperser S25匀浆器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

羊前腿肉在室温下解冻2 h，去掉可见的筋膜和脂肪，切成小块后用绞肉机搅碎成肉糜。称取30 g肉糜制成直径6 cm、厚1 cm的圆形肉饼。将肉饼在500～600 ℃条件下炭火烤制10 min，直至肉饼的中心温度达到72 ℃左右，炭火与肉之间的距离为10 cm。将烤制好的肉饼置于－20 ℃备用，每个样品3 个重复。

1.3.2 标准溶液的配制

准确称取16 种HAs标准品各5.0 mg溶于甲醇中，并定容至50 mL，得16 种100 μg/mL各HAs标准储备液。再吸取各种HAs储备液制成质量浓度分别为1、5、10、50、100、200 ng/mL和500 ng/mL的系列混合标准溶液，以此建立标准曲线。

1.3.3 HAs提取方法

采用串联固相萃取法（Extrelut-PRS-C18、 PRS-C18）[16,22-23]、MCX固相萃取柱萃取法[2]和分散固相萃取法（QuEChERS法）[24]3 类4 种方法对肉制品中HAs进行提取。

1.3.3.1 Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法

称取2.0 g搅碎后的炭烤羊肉与12 mL 1 mol/L NaOH溶液混合，将搅拌好的匀浆物与10 g硅藻土充分混匀后，将其填充到Extrelut NT20空柱中。首先将PRS柱活化（用5 mL含5%甲苯的二氯甲烷），用60 mL含5%甲苯的二氯甲烷将HAs从Extrelut NT20柱洗脱到预先活化的PRS柱中，使洗脱液完全通过PRS柱。然后依次用6 mL 0.01 mol/L盐酸、15 mL甲醇-0.3 mol/L盐酸（1∶1，V/V）、2 mL水洗脱PRS柱。将洗脱液收集于100 mL离心管中，加入0.5 mL浓氨水，然后用25 mL蒸馏水稀释混匀（该步骤得到非极性HAs）。将该混合液通过500 mg C18柱（预先用5 mL甲醇和10 mL水活化），再用2 mL水冲洗C18柱；用20 mL 0.5 mol/L醋酸铵溶液（pH 8.2）再次洗脱PRS柱得到极性HAs混合液，将混合液通过500 mg C18柱（预先用5 mL甲醇和10 mL水活化），再以2 mL水淋洗去除杂质。两部分C18柱中的HAs分别用1 mL甲醇-氨水（9∶1，V/V）混合液洗脱，将两部分洗脱液收集并混合，过0.22 μm的滤膜，滤液有待分析。

1.3.3.2 PRS-C18固相萃取柱萃取法

称取2.0 g搅碎后的炭烤羊肉与10 mL乙酸乙酯和2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液混合，涡旋振荡3 min，5 000×g离心5 min，取上清液放入50 mL离心管中，用同样的方法再提取2 次，将上清液混合。除去离心管底部的水，将乙酸乙酯提取物氮吹吹干，用6 mL二氯甲烷（一次2 mL，共3 次）复溶。用5 mL二氯甲烷对PRS柱进行活化，将复溶液添加到PRS柱中，分别用6 mL 0.1 mol/L HCl溶液、15 mL甲醇-0.1 mol/L HCl（50∶50，V/V）混合液、2 mL蒸馏水洗脱PRS柱，收集洗脱液于100 mL的离心管中得到非极性HAs，再用0.5 mL氨水中和洗脱液，添加到预先用2 mL甲醇和5 mL水活化的C18柱中；用20 mL 0.5 mol/L醋酸铵溶液（pH 8.5）再次洗脱PRS柱，得到极性HAs，添加到预先用2 mL甲醇和5 mL水活化的500 mg C18柱中。最后分别用1 mL甲醇-氨水（9∶1，V/V）混合液洗脱2 个C18柱，将两部分洗脱液收集并混合，过0.22 μm的滤膜，滤液有待分析。

1.3.3.3 MCX固相萃取柱萃取法

称取3.0 g搅碎后的炭烤羊肉与30 mL 1 mol/L NaOH溶液混合，振荡1 min。将该碱性溶液与13 g硅藻土混合，添加50 mL乙酸乙酯并超声萃取30 min，重复2 次萃取，收集上清液。该液于4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清液。将上清液（10 mL）乙酸乙酯层通过预先分别用6 mL甲醇、蒸馏水和0.1 mol/L盐酸活化的MCX柱子中。然后依次用盐酸（6 mL、0.1 mol/L）和甲醇（6 mL）冲洗MCX柱子。用6 mL氨化甲醇（甲醇-氨水（19∶1，V/V））对小柱填料中吸附的HAs进行洗脱。采用氮吹仪将收集HAs的氨化甲醇洗脱液吹干，添加1.0 mL甲醇复溶。采用0.22 μm有机针头式滤器过滤，将过滤后的复溶液于－20 ℃条件下密封保存，待进样。

1.3.3.4 QuEChERS法

称取2.0 g搅碎后的炭烤羊肉装入50 mL离心管中，放入1 块陶瓷均质石和10 mL去离子水，振荡20 min，加入10 mL含有1%醋酸的乙腈混合液，再次振荡15 min。加入萃取粉包（包括4 g无水硫酸镁和1 g无水醋酸钠），振荡1 min，然后在4 ℃、3 200×g离心10 min。取上清液6 mL加入净化用粉末管中，其中含有900 mg无水硫酸镁、300 mgN-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和300 mg C18EC（封端的反相十八硅烷硅胶颗粒），1 000 r/min均质1 min，4 ℃、3 200×g离心5 min，取1 mL上清液用氮吹仪吹干，加入1.0 mL甲醇溶液，涡旋振荡，使样品溶解，将溶液通过0.22 μm的PVDF滤膜过滤，最后进行UPLC-MS/MS分析。

1.3.4 检测条件

1.3.4.1 色谱条件

色谱柱：Orbax SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，80 Å（PN∶ 822700-902），安捷伦公司）；流速0.300 mL/min；柱温30 ℃；进样量2 μL。流动相体系： A为10 mmol/L乙酸-乙酸铵缓冲液（pH 2.9），B为乙腈；梯度洗脱程序见表1。

表1 16 种HAs分离的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program for separation of 16 HAs

1.3.4.2 质谱检测条件

电离方式：ESI+；扫描方式：多反应监测；监测离子参数见表2。

表2 16 种HAs特征离子质谱条件Table 2 Mass spectrpmetric parameters for 16 HAs

续表2

1.3.5 HAs前处理的方法学考察

本研究对4 种前处理方法的MS/MS检测方法线性范围、检出限（limits of detection，LOD）、定量限（limits of quantification，LOQ）、加标回收率、精密度等方法学参数进行分析。HAs加标回收率：在炭烤肉饼中添加10、50、100 ng/g 3 个添加量的HAs混合标准溶液，按照1.3.3节和1.3.4节方法检测分析，计算回收率和精密度。分别以3 倍信噪比和10 倍信噪比为该方法对各种HAs的LOD和LOQ。

1.4 数据处理

本实验采用Excel 2016软件处理数据并绘制表格，指标均为3 次平行测定结果，结果用平均值表示。利用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，并进行Duncan法多重比较，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 方法学评价

2.1.1 线性范围、线性方程及相关系数

采用1.3.3节和1.3.4节方法对肉制品中的HAs进行提取和检测分析。以各种HAs质量浓度为横坐标，峰面积y为纵坐标绘制标准曲线，所得线性方程和相关系数见 表3。结果表示，该检测方法中16 种HAs的R2均大于0.999，16 种HAs在1～500 ng/mL范围内线性关系良好，可以满足定量分析的需要。

表3 16 种HAs的线性范围、线性方程、相关系数Table 3 Linear ranges, calibration curve equations, and correlation coefficients for 16 HAs

2.1.2 LOD和LOQ测定结果

由表4可以看出，在4 种不同的前处理方法中，16 种HAs的LOD和LOQ差异显著（P＜0.05）。Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法中16 种HAs的LOD为0.03～0.50 ng/g，LOQ为0.11～1.66 ng/g；PRS-C18固相萃取柱萃取法中16 种HAs的LOD为0.04～0.60 ng/g，LOQ为0.15～2.01 ng/g；MCX固相萃取柱萃取法中16 种HAs的LOD为0.01～0.50 ng/g，LOQ为0.03～1.67 ng/g； QuEChERS法中16 种HAs的LOD为0.01～0.32 ng/g，LOQ为0.04～1.05 ng/g。对于LOD，MCX固相萃取柱萃取法中7,8-DiMeIQx的LOD为0.02 ng/g，显著低于（P＜0.05）其他3 种方法；QuEChERS法中，IQx、Trp-P-2、MeAαC的LOD显著低于（P＜0.05）其他3 种方法；在MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法中，MeIQ、7,8-DiMeIQx、Harman和AαC的LOD显著低于其余2 种方法 （P＜0.05）。对于LOQ，在MCX法中，4,7,8-TriMeIQx的LOQ为0.03 ng/g，显著低于其他3 种方法（P＜0.05）；在MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法中，MeIQ、7,8-DiMeIQx、Harman、PhIP、AαC、Trp-P-2的LOQ显著低于其他3 种方法（P＜0.05）。综上所述，MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法的LOD和LOQ较低。

表4 16 种HAs的LOD和LOQTable 4 LODs and LOQs for 16 HAs ng/g

2.1.3 回收率和精密度实验结果

选用4 种不同的前处理方法对HAs进行提取，并用UPLC-MS/MS进行检测，进行高、中、低3 个水平的加标回收实验，测定结果见表5。

表5 炭烤羊肉饼中16 种HAs的加标回收率和精密度Table 5 Recoveries and precision for 16 HAs spiked in charcoal roasted mutton patties

续表5

2.1.3.1 Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法结果分析

Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法结果表明，Glu-P-1、Norharman、Harman和AαC回收率为64.31%～123.46%，其余12 种HAs的回收率较差，其中IQx回收率仅为3.14%～35.04%。前人研究结果表明，此方法中IQ型HAs回收率低于50%[25-26]。该研究方法的大量实验数据表明，HAs回收率低的原因是提取硅藻土的提取性能较差[27]。由于所检测的16 种HAs极性范围宽，有极性和非极性2 种，因此要保证这16 种HAs有很高的回收率有一定的困难。万可惠等[22]建立了固相萃取-高效液相色谱同时测定牛肉制品中IQ、MeIQ、4,8-DiMeIQx、Norharman、Harman、Trp-P-1、Trp-P-2、PhIP、AαC、MeAαC 10 种HAs的方法，结果表明，10 种HAs的加标回收率为61.69%～101.81%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.28%～7.81%，其中Trp-P-1、Trp-P-2和IQ的回收率分别为64.91%、75.60%和83.19%。Totibio等[28]用固相萃取法从不同的冻干肉汁中提取16 种HAs，他们同样使用Extrelut作为吸附剂，接着使用PRS和C18柱进行纯化、最后使用LC-MS对HAs进行测定和定量，结果显示16 种HAs的LOD为0.4～11.7 ng/g[28]。 Costa等[29]采用相似的方法对烧烤沙丁鱼和鲑鱼样品中的14 种HAs进行检测，其中有9 种HAs的回收率超过50%，然而Trp-P-1、Trp-P-2、AαC、MeAαC、PhIP的回收率范围仅为23%～32%。

2.1.3.2 PRS-C18固相萃取柱萃取法结果分析

PRS-C18固相萃取柱萃取法结果表明，当添加量为10 ng/g时，14 种HAs的回收率为25.33%～54.79%，而IQx和AαC的回收率分别为65.61%和86.11%。当添加量为50 ng/g和100 ng/g时，15 种HAs回收率为62.23%～104.95%，GIu-P-1的回收率为54.65%～57.63%。此方法中，16 种HAs的精密度良好，为0.06%～12.26%。Janoszka等[30]对比4 种前处理方法对HAs提取效果的影响，结果表明使用硅藻土、C18和PRS柱提取HAs最为简便，回收率分别为IQ 85%、MeIQ 50%、MeIQx 46%、4,8-DiMeIQx 62%、PhIP 50%。邵斌等[31]建立了固相萃取-高效液相色谱同时测定传统禽肉制品中9 种HAs，包括IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、PhIP、Trp-P-1、Trp-P-2、Norharman、Harman，经过条件优化，选用乙酸乙酯进行提取，提取液经PRS和C18固相萃取小柱净化，3 个加标水平的平均回收率为60.47%～90.55%（n= 6），RSD为0.49%～9.74%（n= 6），LOD为0.1～3.6 μg/kg。该方法需要高效繁琐的预处理步骤去除肉中的干扰成分（如脂肪、无机盐、碳水化合物和蛋白质等），耗时长，而且在转移过程中，容易造成萃取液损失，因此在实际应用中不方便，尤其是在分析大样本实验中[32-33]。

2.1.3.3 Oasis MCX萃取方法结果分析

MCX固相萃取柱萃取法结果表明，IQ、IQx、Trp-P-1和MeAαC的回收率为34.43%～79.31%。其余12 种HAs的回收率为62.43%～100.37%，精密度为0.32%～57.94%。Yan Yan等[34]建立了基于酸提取和使用Oasis MCX固相萃取柱一步固相萃取纯化的方法，对肉饼中11 种极性HAs进行提取，11 种HAs的回收率为58.2%～107.7%。然而该方法只能提高有限数量的中、强极性HAs。基于此，Yan Yan等[35]进一步建立了一种基于乙腈萃取和Oasis MCX一步纯化的新型预处理方法，测定烤肉中17 种HAs，包括11 种极性HAs和6 种非极性HAs。同时与2 种改进的Gross法进行对比，结果表明，改进的方法1用硅藻土和乙酸乙酯代替二氯甲烷和Extrelut柱，用Oasis MCX代替PRS和C18固相萃取柱。方法2与方法1类似，只是在硅藻土和碱液混合后，又进行了微波萃取。结果表明方法1的回收率为32.7%～78.5%，方法2的回收率为33.7%～74.9%，且2 种方法结果没有显著差异 （P＞0.05），而用乙腈提取的HAs能够获得更好的回收率（42.5%～99.0%）和更好的精密度（低于12.2%）。这一方法较传统方法而言，在一定程度上缩短了前处理时间，但是会耗费大量的有机试剂，在一定程度上会对人体的健康造成损害。

2.1.3.4 QuEChERS法结果分析

本实验中QuEChERS法取得良好的回收率和精密度，16 种HAs的回收率为76.66%～119.27%，精密度为0.44%～18.57%。Hsiao等[19]用QuEChERS结合HPLC-ESI-MS/MS测定猪肉酥中的20 种HAs，回收率为58.9%～117.4%，LOD为0.003～0.05 ng/g，LOQ为0.01～0.05 ng/g。同时Chang等[18]也用QuEChERS法实现了同步检测食用油中20 种HAs。Jian等[36]研究了用液-液萃取结合SPE和QuEChERS法提取肉制品中11 种HAs，结果表明，QuEChERS法提供了更好的线性范围和更高的灵敏度。Xian Yanping等[17]还使用了QuEChERS法及Fe3O4纳米颗粒脱色法对咖啡产品中的HAs进行萃取和纯化，同时结合UPLC-MS/MS对14 种HAs进行测定，结果表明，14 种HAs的日内平均加标回收率为81%～101%，精密度为5.0%～7.8%。

综上所述，在4 种不同的提取方法中，QuEChERS法有较高的回收率和精密度，能够较好地检测肉中的16 种HAs。

2.2 前处理成本分析

由表6可知，Oasis MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法的经济成本低，提取一个样品所需萃取柱成本分别约为32.01 元和69.79 元，而NT20-PRS-C18和PRS-C18固相萃取柱萃取法成本较高，是Oasis MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法的1.1～3.3 倍，采用Oasis MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法前处理提取肉制品中的HAs较为经济；与此同时，由表6得知，QuEChERS萃取法所花时间最少，前处理一个样品所需时间仅为0.5 h，其余3 种前处理方法均超过1 h，特别是对于大批量处理肉制品中的HAs时，QuEChERS萃取法显示出了较强的优势。

表6 制备单个样本所需成本计算Table 6 Comparison of cost and extraction time required for preparation of a single sample using four extraction methods

3 结 论

本实验以肉制品为实验原料，采用串联固相萃取法（Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法、PRS-C18固相萃取柱萃取法）、MCX固相萃取柱萃取法和分散固相萃取法（QuEChERS法）4 种前处理方法对肉制品中16 种HAs进行提取，并采用UPLC-MS/MS对提取物进行分析。结果表明：1）在Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法中，Glu-P-1、Norharman、Harman和AαC回收率为64.31%～123.46%，其余12 种HAs的回收率较差，其中IQx的回收率仅为3.14%～35.04%。16 种HAs的LOD为0.03～0.50 ng/g，LOQ为0.11～1.66 ng/g；在PRS-C18固相萃取柱萃取法中，当添加量为10 ng/g时，14 种HAs的回收率为25.33%～54.79%，而IQx和AαC的回收率分

别为65.61%和86.11%。当添加量为50 ng/g和100 ng/g 时，15 种HAs回收率为62.23%～104.95%，Glu-P-1的回收率为54.65%～57.63%。此方法16 种HAs的LOD为0.04～0.60 ng/g，LOQ为0.15～2.01 ng/g，精密度为0.06%～12.26%；在MCX固相萃取柱萃取法中，IQ、IQx、Trp-P-1和MeAαC的回收率为34.43%～79.31%，其余12 种HAs的回收率为62.43%～100.37%，精密度为0.32%～57.94%，LOD为0.01～0.50 ng/g，LOQ为0.03～1.67 ng/g；QuEChERS法的回收率为76.66%～115.10%，精密度为0.44%～18.57%，LOD为0.01～0.32 ng/g，LOQ为0.04～1.05 ng/g。相比较于其他3 种方法而言，QuEChERS法有更好的回收率和精密度。2）MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法提取单个HAs所需成本较低、时间较短。MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法提取单个样品所需萃取柱价格分别为32.01 元和69.79 元，所需时间分别为1.2 h和0.5 h。综合而言，QuEChERS法具有快速、简便、稳固的特点，容易实现大样本检测。