高效液相色谱法测定母乳及牛乳中总核苷酸含量

杨璐桐，于 苗，郭志恒，田 芳，毛颖异，蔡小堃，Philip HASELBERGER，赵艳荣,，谢 林,

（1.吉林大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院产科，吉林 长春 130021；3.雅培营养中国研发中心，上海 200233；4.雅培营养品，美国 俄亥俄 哥伦布 OH43219）

核苷酸是由含氮碱基、五碳糖（核糖或脱氧核糖）和1～3 个磷酸基团组成[1-2]。嘌呤或嘧啶碱基与戊糖分子连接构成核苷，核苷酸是核苷的磷酸酯形式，并且可以单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯形式存在[3]。多个核苷酸聚合而成核酸，包括DNA和RNA两大类[4]。母乳中的核苷酸中的氮占非蛋白氮含量的2%～5%[5]，对婴幼儿的生长发育、脂质代谢、肠道菌群及肠道发育、免疫功能等有重要作用[6-10]。核苷酸在母乳和牛乳中的存在形式多种多样，除游离形式核苷酸外，还富含有核苷聚合物（如RNA）及加合物（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和二磷酸尿苷葡萄糖）等不同核苷形式[11-12]。这些核苷类物质可由小肠中的核酸酶及磷酸酶等水解为核苷酸，从而发挥与核苷酸同等的生理功能[13-15]。母乳中游离核苷酸、游离核苷、核苷聚合物及加合物都可以作为母乳中可利用核苷酸的来源，本研究将不同来源的可利用核苷总量称为总核苷酸。与大多数婴儿配方奶中的牛乳相比，母乳含有更多的核苷酸、核苷等非蛋白氮化合物[16-18]。我国于2005年正式允许核苷酸添加到婴幼儿配方食品中，允许添加的核苷酸形式为胞嘧啶核苷酸（cytidine monophosphate，CMP）、尿嘧啶核苷酸（uridine monophosphates，UMP）、鸟嘌呤核苷酸（guanosine monophosphates，GMP）、腺嘌呤核苷酸（adenosine monophosphates，AMP）、次黄嘌呤核苷酸（inosine monophosphates，IMP）。

现阶段大多数关于核苷酸的研究都集中在测定游离核苷酸上，主要检测方法为高效液相色谱法[19-21]，但只检测游离核苷酸，未考虑母乳中的核苷加合物和聚合物等物质，可能会低估母乳中可利用的核苷酸总量。所以Leach等[22]用母乳中总潜在可利用核苷的量代表核苷酸总量，建立了一种使用高效液相色谱法检测乳汁中总核苷酸的方法。Tressler等[23]参考了Leach等[22]的方法检测了亚洲妈妈母乳中的总核苷酸。Liao等[24]建立了中国台湾地区母乳中核苷酸和核苷的检测方法。Gill等[25-26]检测了牛乳和羊乳中总核苷酸含量。但这些研究关于母乳中核苷酸的含量和组成的结果存在较大差异，尤其是在母乳中天然存在的核苷酸类型上。Leach[22]和Tressler[23]等指出，母乳中仅存在CMP、UMP、GMP、AMP四种类型。而Liao等[24]则检测出5 种类型，除以上4 种外，还检测到IMP。且现有的检测母乳中总核苷酸研究中，方法验证数据并不全面，仅报道了加标回收率和精密度，线性范围、检出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）等鲜见报道[22-23]。母乳是一种非常复杂的样品基质，如何消除样品基质的干扰，调查其天然的核苷酸含量和组成，仍需进一步的研究探索。

本研究在Leach等[22]方法的基础上，对母乳核苷酸含量和组成的测定方法进行优化和改进，并对改进方法在母乳基质中的性能进行全面验证。验证参数包括该方法的分析范围、线性、LOD、LOQ、准确性及精密度。进一步使用建立的方法检测了母乳及市面上常见的5 种牛乳样品中核苷酸总量和组成，以验证该方法的适用性。

1 材料与方法

1.1 材料

研究使用的母乳样品为长春地区成熟乳样品（n=10，产后40～45 d），收集于吉林省长春市吉林大学第一医院正常产的健康产妇；5 种牛乳样品购于当地市场，分为膜过滤牛乳、巴氏杀菌全脂牛乳、巴氏杀菌脱脂牛乳、超高温瞬时灭菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）全脂牛乳、UHT脱脂牛乳，基本信息见表1。

表1 牛乳样品营养成分 Table 1 Nutritional information of cow milk samples

1.2 试剂与仪器

磷酸二氢钾、氢氧化钠、六水合氯化镁、七水合硫酸锌、乙酸、氢氧化铵（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；己烷磺酸钠、磷酸、乙腈、异丙醇（均为色谱纯） 赛默飞世尔科技公司；胞嘧啶核苷（纯度100%）、尿嘧啶核苷（纯度100%）、鸟嘌呤核苷（纯度99%）、腺嘌呤核苷（纯度100%）、次黄嘌呤核苷（纯度100%）标准品及5-甲基胞苷（5-methylcytidine，5-MC）（纯度≥99%）、1-甲基鸟苷（1-methylguanosine，1-MG）（纯度100%）、核酸酶（NP1）、焦磷酸酶、碱性磷酸酶、核糖核酸 美国Sigma-Aldrich公司；硼化聚丙烯酰胺凝胶（Affi-Gel 601） 美国Bio-Rad公司。

1260 Infinity反相高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准储备液的配制及标准曲线的建立

分别准确称取5 种核苷标准品（AMP、CMP、GMP、IMP、UMP）30～40 mg（精确至0.000 1 g），用0.1 mol/L氢氧化钠溶液定容至100 mL，配制成标准储备液，－20 ℃保存。用0.25 mol/L磷酸二氢钾（pH 3.5）溶液将5 种标准储备液稀释50 倍，使用紫外分光光度计测定其吸光度。标准储备液质量浓度根据 表2和下式进行计算：

表2 核苷酸的最大紫外吸收波长和换算因子Table 2 Maximum UV absorption wavelengths and calculation factors for nucleotides

分别称取5-MC 15 mg和1-MG 6 mg，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液定容至25 mL，配制成内标储备液。稀释10 倍后即成为内标工作液。

取5 种标准储备液各1 mL置于同一50 mL容量瓶中，用超纯水定容至50 mL。取此混合标准储备液逐级稀释成不同质量浓度，配制成混合标准工作液（表3）。将混合标准工作液依次进行高效液相色谱分析，记录各组分色谱图上的峰面积。以混合标准工作液质量浓度与内标质量浓度的比值（X）为横坐标，以各组分的峰面积与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。 1.3.2 样品前处理

表3 混合标准工作液的配制Table 3 Preparation of mixed standard working solutions

准确吸取0.5 mL母乳样品或牛乳样品于玻璃瓶中，加入250 µL内标工作液和2.5 mL水，110 ℃加热15 min，取出冷却至室温。再依次加入1 mL醋酸钠溶液（0.1 mol/L，pH 5.1）、25 µL硫酸锌溶液（0.01 mol/L） 和50 µL NP1（～2.5 个单位），37 ℃酶解16～18 h。酶解结束后，再加入0.5 mL醋酸铵溶液（0.5 mol/L，pH 8.75）、25 µL氯化镁溶液（1 mol/L）、25 µL氢氧化铵、25 µL焦磷酸酶（～12 个单位）和25 µL碱性磷酸酶（～7 个单位），37 ℃酶解3 h，酶解后的样品用磷酸二氢钾溶液（0.5 mol/L，pH 10.5）定容至12 mL。

1.3.3 固相萃取

将硼化聚丙烯酰胺凝胶与磷酸二氢钾溶液（0.1 mol/L， pH 6.5）按1∶100的比例充分混合后，取0.5 mL分装于1.5 mL离心管中。将离心管中的水合沉淀凝胶用磷酸溶液（0.25 mol/L）涡旋洗涤1 次，再用磷酸二氢钾溶液（0.25 mol/L，pH 10.5）涡旋洗涤1 次，3 000 r/min离心2 min并除去上清液。取1 mL处理好的样品加入洗涤后的凝胶中并涡旋，静置15 min，使核苷吸附于凝胶上。再次用磷酸二氢钾缓冲液（0.25 mol/L，pH 10.5）进行2 次洗涤，3 000 r/min离心2 min并除去上清液。母乳中含有多种营养素，除核苷酸能吸附在凝胶上，其他物质也可能吸附在凝胶上，用磷酸二氢钾洗涤2 次则是为了除去这些吸附在凝胶上的可能影响结果的物质，但不会影响吸附在凝胶上的核苷。向离心管中加入1 mL磷酸溶液（0.25 mol/L）并充分涡旋，此时核苷从凝胶中洗脱出来，然后将离心管中的液体通过0.2 µm尼龙滤膜直接进入进样小瓶进行高效液相色谱分析。

1.3.4 色谱条件

色谱柱为Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，3.5 µm），进样量100 µL，进样盘温度16 ℃，柱温22 ℃，检测波长260 nm。流动相A为21.75 mmol/L醋酸铵溶液（pH 4.27）-2 mmol/L己烷磺酸钠；流动相B为流动相A-乙腈（100∶6，V/V）。梯度洗脱程序见表4。

表4 高效液相色谱检测总核苷酸梯度洗脱程序Table 4 Gradient elution program for HPLC analysis of total nucleotides

1.4 统计学分析

采用SPSS 24.0进行数据处理与分析。采用单因素方差分析ANOVA评估多个样本间数据差异的显著性。若结果有显著性差异，用最小显著性差异法进行样品间的两两比较。P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

考虑到母乳样品量的有限性，在样品前处理时将样品使用量减至0.5 mL，并验证方法的灵敏度。使用5-MC作为AMP、UMP、CMP及IMP的内标，同时使用1-MG作为GMP的内标。因GMP在硼化聚丙烯酰胺凝胶上的保留时间较其他4 种核苷酸长，1-MG与其性质更接近，可以更加精确地对其进行定量。

关于核苷酸在母乳中的天然存在类型，本研究也进行了探讨。有研究报道母乳中存在腺苷脱氨酶、酸性磷酸酶等活性酶[27]，这些酶的存在可能会改变母乳中核苷酸的天然组成，造成前言中所述不同研究间结果的差异较大。研究显示，高温加热一定的时间（110 ℃加热15 min）可以使乳汁中存在的活性酶充分灭活[23]。所以本研究在进行样品前处理时，增加高温灭活步骤，并通过加标回收实验验证有无此步骤对核苷酸检测结果的影响。选择一个母乳样品为基质，3 d 6 次测定结果的平均值确定该基质中各核苷酸及核苷酸总量的本底值（为得到稳定的本底值，在处理样品过程中增加了高温灭活步骤，因此样品中未检出IMP），其加标回收实验结果如表5所示。未增加高温灭活步骤时，CMP、UMP及GMP的回收率分别为98%、122%及85%，基本符合检测方法性能指标的要求；但AMP和IMP的加标回收率分别为15%及180%，提示两种核苷酸在前处理过程中可能发生了相互转化。增加高温灭活步骤后，AMP和IMP的加标回收率回归至可接受范围（分别为93%及80%），结果同时显示有无高温灭活步骤对总核苷酸含量的检测无显著影响。母乳中的腺苷脱氨酶可以将AMP转化为IMP[28]，而增加高温加热步骤可以使腺苷脱氨酶失去活性，从而可以检测到母乳中核苷酸的真实含量和组成，而且大部分研究均未报道IMP含量[22,29-30]，仅有少部分研究报道了IMP含量[24]。本研究进一步证实了Leach[22]及Tressler[23]等的研究结果，母乳中主要含有CMP、UMP、AMP及GMP四种核苷酸，IMP为样品前处理不当致使AMP转化的结果。

表5 有无高温灭活步骤时加标回收率结果对比Table 5 Comparison of recoveries of spiked samples with and without high-temperature inactivation step

2.2 线性、LOD及LOQ测定结果

取配制的混合标准工作液对该方法的分析范围及线性关系进行考察，结果见表6。5 种核苷酸在各自的分析范围内线性关系良好，相关系数（r2）均在0.999以上。计算10 个母乳样品中待分析物色谱峰的平均信噪比（RSN），并将RSN为3对应质量浓度作为本方法各核苷酸的LOD，RSN为10对应质量浓度作为本方法各核苷酸的LOQ，经检验LOD为0.18～0.45 mg/L，LOQ为0.60～1.51 mg/L。图1为母乳样品的典型色谱图，本方法使用硼化聚丙烯酰胺凝胶进行样品净化，各种类型的核苷酸分离度较好，且杂峰少，本方法具有非常好的灵敏度。

表6 线性范围、回归方程、相关系数r2、LOD和LOQTable 6 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs

图1 母乳样品中核苷酸谱图Fig. 1 Chromatogram of nucleotides in human milk

2.3 精密度及回收率实验结果

选择一个母乳样品为基质，3 d 6 次测定结果的平均值确定该基质中各核苷酸及核苷酸总量的本底值。加入不同体积的混合标准储备液进行加标回收实验，使用建立的方法测定总核苷酸，验证结果见表7。本研究选择3 个不同的加标质量浓度，分别约为基底质量浓度的30%、50%和120%。在50%及120%质量浓度水平进行加标回收以验证含量测定的准确性；30%质量浓度水平贴近并稍高于计算所得的LOQ，可以验证其作为母乳样品检测实际LOQ的适用性。结果表明，各核苷酸的加标回收率均在82%～120%之间，总核苷酸的加标回收率均在99%～108%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在0.8%～7.8%之间，表明此方法具有良好的准确性及精密度。CMP、UMP、GMP、AMP及IMP在母乳中的实际检测LOQ分别为2.60、2.00、1.98、2.31、1.97 mg/L。

表7 母乳样品中总核苷酸的加标回收率及精密度（n =6）Table 7 Recoveries and precision of total nucleotides in spiked human milk samples (n = 6)

2.4 母乳及牛乳样品的测定与分析

采用上述方法检测长春地区收集的10 个成熟乳样品（40～45 d）及5 种不同加工工艺生产的牛乳样品（膜过滤牛乳、巴氏杀菌全脂牛乳、巴氏杀菌脱脂牛乳、UHT全脂牛乳和UHT脱脂牛乳）中总核苷酸的含量及组成，检测结果见表8。所检测的母乳和牛乳样品中不同种类核苷酸及总核苷酸含量均在本方法线性范围内，且检测值均高于LOQ（0.60～1.51 mg/L）。每个样品在检测时均设置平行样，结果平行性好。该方法的灵敏度及精密度均可满足对母乳和牛乳样品中天然的核苷酸含量及组成的测定要求。

表8 牛乳及母乳样品中总核苷酸含量 Table 8 Contents of total nucleotides in cow milk and breast milk samples

在检测过程中发现母乳中总核苷酸含量具有较大的个体差异性，不同母乳样品含量相差近10 倍（10.85～101.57 mg/L），Leach等[22]研究结果也表明母乳中核苷酸含量具有较大的个体差异 （82～402 µmol/L）。有报道指出母乳中RNA质量浓度范围为100～5 600 mg/L[31]，而RNA在乳汁中所占比例约为40%～56%，所以母乳中核苷酸的个体差异可能主要受RNA含量的影响。为进一步验证此假设，本研究使用低核苷酸含量的母乳样品作为基质进行RNA加标回收实验，以验证结果的准确性，结果见表9。重复检测3 次实验结果表明RNA的加标回收率为98%，表明乳汁中的RNA可以被完全水解，低核苷酸含量的母乳中并无影响方法性能的干扰因素。RNA加标实验进一步验证了本方法对母乳基质普遍适用，所测结果可以反映乳汁中真实的核苷酸水平。

经统计检验发现，母乳中总核苷酸含量显著高于5 种不同牛乳（P＜0.05），牛乳中总核苷酸的含量约为母乳中含量的一半或更低。本研究中膜过滤牛乳、巴氏杀菌全脂牛乳和巴氏杀菌脱脂牛乳中总核苷酸含量均高于UHT全脂牛乳和UHT脱脂牛乳（P＜0.05）。膜过滤牛乳、巴氏杀菌全脂及脱脂牛乳均产自中国，UHT全脂及脱脂牛乳产自新西兰，这两类牛乳之间的差异可能源自产地，也可能源自加工方式。有研究报道季节因素会影响牛乳中总核苷酸含量，气候条件、母牛的饲养和喂养条件，日光照射和其他环境因素都可能影响牛乳中总核苷酸含量[26]。所以不同牛乳间含量差异的原因仍需进一步探究。

本研究还对乳汁中各种核苷酸所占比例进行比较，各种核苷酸在牛乳和母乳中所占的比例如图2所示。母乳和牛乳中均以嘧啶类核苷酸为主（78%～93%），嘌呤类核苷酸为辅（7%～22%）。但母乳中CMP占据主导地位，牛乳中则以UMP为主，且母乳中的嘌呤类核苷酸高于牛乳。母乳和牛乳之间的差异不仅体现在含量上，在核苷酸组成方面也存在差异。

3 结 论

本研究建立了一种高效、准确测定母乳和牛乳中总核苷酸含量和组成的方法。该方法具有较好的灵敏度、准确性和精密度，能满足日常对母乳或牛乳样品中总核苷酸的定性和定量测定要求。本研究根据母乳样品的特性，样品前处理中增加了高温灭活步骤，消除了母乳中活性酶对核苷酸组成的影响，对研究母乳中核苷酸的组成有重要意义。应用研究结果显示，母乳中的总核苷酸含量明显高于牛乳，牛乳中的含量约为母乳的一半。嘧啶核苷酸（CMP、UMP）是母乳和牛乳中主要的核苷酸形式，嘌呤类核苷酸（AMP、GMP）所占比例较小，且未检测到IMP。本研究为今后母乳和牛乳的核苷酸总量及组成研究提供了一种更加科学准确的方法。