不同脂肪来源婴儿配方奶粉与母乳的 甘油酯组成差异

李晓东，常淤浩，潘 悦，林 爽，刘 璐，张宏达，周星宇，马 欣

（东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

母乳（human milk，HM）脂肪是婴儿重要能量来源，可为出生6 个月内的婴儿提供45%～55%所需 能量[1]。HM脂肪主要包括甘油三酯（triglyceride，TG，占总脂肪98%～99%）、磷脂（占总脂肪0.26%～0.80%）、甾醇（占总脂肪0.25%～0.34%，其中主要是胆固醇）及其他低丰度脂肪，如甘油一酯、甘油二酯（diglyceride，DG）、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）等[2-6]。TG是HM脂肪的主要成分，由甘油连接3 个脂肪酸分子构成，其性质与功能根据其所连接的脂肪酸种类、位置的不同具有很大差异，这种差异不仅会影响乳脂的理化性质，还与人体吸收效率有关[7-9]。目前已经从HM中鉴别出400余种TG[10-11]，且发现其脂肪酸分布并非完全随机，大多数饱和脂肪酸都酯化在sn-2位置。其中约70%的sn-2位置被C16:0占据[2,12]。

为了实现脂肪组成HM化，目前婴儿配方食品中婴儿配方奶粉（infant formula powder，IFP）是市场上常见的形式，多采用多种油脂复配的方式调节脂肪酸组成，其中植物油和牛乳脂是目前IFP中最常见的脂肪来源[13]。此外，还有少量添加海藻油、鱼油补充配方粉中的多不饱和脂肪酸[14]。这些脂肪的添加虽然使IFP在部分重要脂肪酸、TG含量上接近了HM，但IFP整体脂肪组 成变得复杂，导致IFP与HM在脂肪消化和吸收效果的差异[15-17]。结构油脂的出现，例如1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（1,3-dioleoyl-2-palmitoyl triglyceride，OPO），虽一定程度上解决了IFP与HM中TG结构差异问题，但目前仍局限于sn-2位棕榈酸结构的TG，而对于HM中其他含量丰富的TG研究尚不深入，对于不同脂肪来源IFP中脂肪的存在形式与HM的差异也尚不明确。因此，本研究选取5 款市售不同脂肪来源的IFP，通过液相色谱-质谱联用法对其甘油酯组成与HM进行比较研究，分析不同脂肪来源的IFP与HM脂肪组成的差异及其可能对脂肪消化产生的潜在影响，以期为IFP的设计与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

HM是由来自哈尔滨的哺乳期志愿者提供的成熟HM（大于产后21 d，n=6），年龄18～30 岁，分娩足月儿，HM充足，孕期或哺乳期间无乳腺炎、感染性疾病、心血管疾病、代谢性疾病、精神系统疾病、癌症及其他恶性消耗性疾病，最近2 周未使用过药物及催乳用西药。采样时间为上午9—11点之间，志愿者母亲一侧乳房在喂哺婴儿时，用电动人乳采集泵同时采集另外一侧乳房的乳汁，同时记录HM的采集时间、乳样质量。HM采集后保存在10 mL冻存管中，编号后迅速降温至－4 ℃，冷藏状态运送至实验室，转移至－80 ℃冰箱避光保存，使用前将不同样品混合，制成混合样品进行实验。HM混合样的脂肪质量浓度为4.2 g/100 mL。

IFP选取了市售的5 种具有不同油脂来源的0～6 个月的婴儿配方粉，包括植物脂肪基配方奶粉IF1、IF2共2 种及牛乳/植物脂肪基配方奶粉IF3～IF5共3 种，如表1所示。

表1 奶粉样品及脂肪来源Table 1 IFP samples and their fat sources

37 种脂肪酸甲酯标准品、氯仿（色谱级）、甲醇（质谱级） 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TripleTOF®5600+四极杆飞行时间串联质谱仪 美国AB SCIEX公司；LC-30A超高效液相色谱仪 日本岛津公司；UGC-24M氮吹仪 北京优晟联合科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪提取

采用Cheong等[18]改善的Folch法并加以调整，将不同脂肪来源的IFP（IF1～5）用超纯水分别配制成脂肪质量浓度4.2 g/100 mL的乳液，取5 mL乳液或HM于50 mL离心管中，加入20 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液和5 mL质量分数0.73% NaCl溶液混匀，超声提取10 min后，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，用注射器吸取下层有机相收集；向剩余上层液中加入10 mL氯仿-甲醇溶液，超声10 min后，于4 ℃、5 000 r/min离心10 min，取下层有机相。合并2 次提取的有机相，氮气吹干，制得脂 肪－20 ℃贮存。

1.3.2 甘油酯检测

称取一定质量脂肪，用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）复溶，制成质量浓度20 mg/mL的脂肪溶液，过0.22 nm有机相滤膜，之后利用液相色谱-飞行时间质谱对脂肪中的TG进行分析。

液相色谱条件：Phenomen Kinetex C18色谱柱（100 m×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为10 mmol/L醋酸铵与乙腈-水（4∶6，V/V）；流动相B为10 mmol/L醋酸铵与乙腈-异丙醇（1∶9，V/V）；流速300 μL/min。洗脱条件：0～12 min，60%～0% A、40%～100% B；12～13.7 min，0%～60% A、100%～40% B；13.7～18 min，60% A、40% B；进样量2 μL。

质谱条件：在Analyst TF 1.7，AB SCIEX软件控制下，基于信息依赖（information dependent acquisition，IDA）功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，采集强度最强且大于100的分子离子对应的二级质谱数据。电子能量35 eV，每50 ms采集15 张二级谱图。电喷雾电离源参数设置如下：雾化气压力60 Pa；辅助气压力60 Pa；气帘气压力30 Pa，温度550 ℃；喷雾 电压5 500 V[19]。

数据处理：使用ProteoWizard软件将原始质谱转化为mzXML格式。再使用XCMS软件进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作。使用基于XCMS软件、R程序包及脂肪二级数据库（源自Lipid Maps）进行脂肪鉴定及定量工作；使用SPSS 23.0和Simca 14.1软件对数据进行差异分析和单变量统计分析。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 IFP与HM的甘油酯组成分析

如表2所示，在不同脂肪来源的配方奶粉和HM中共检出DG 12 种、TG 30 种，其中HM的DG相对含量很高，为（7.84±0.57）%，这与前期研究中HMDG含量较高的趋势一致[20]。另外，HM中相对含量最高的DG种类为DG(18∶2/18∶2)和DG(18∶1/18∶1)，二者占HM中总DG的80%以上。同时，HM中相对含量最高的TG种类为TG(16∶0/18∶1/18∶2)、TG(16∶0/18∶1/18∶1)、TG(16∶0/18∶0/18∶1)、TG(12∶0/12∶0/16∶1)、TG(18∶0/18∶2/18∶2)，这一结果与文献[21-22]中1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯为中国地区HM中含量最高的TG类物质。

表2 不同脂肪来源的IFP与HM的DG和TG组成Table 2 DG and TG compositions in IFP with different fat sources and HM

植物油基的IF1、IF2中，相对含量最高的TG种类均为TG(18∶1/18∶1/18∶1)、TG(16∶0/16∶0/18∶1)、TG(16∶0/18∶1/18∶1)和TG(16∶1/17∶2/22∶6)。而添加了牛乳脂的IF3、IF4和IF5含量最高的TG种类各不相同，其中IF3相对含量最高的TG种类为TG(16∶0/18∶1/18∶1)、TG(16∶1/17∶2/22∶6)、TG(18∶1/18∶1/18∶1)和TG(16∶0/16∶0/18∶2)，IF4相对含量最高的TG种类为TG(18∶1/18∶1/18∶1)、TG(16∶0/18∶1/18∶1)、TG(16∶0/18∶1/18∶2)和TG(18∶0/18∶2/18∶2)，IF5相对含量最高的TG种类则为TG(16∶1/17∶2/22∶6)、TG(16∶0/17∶1/22∶6)、TG(18∶2/18∶2/18∶2)和TG(18∶1/18∶1/18∶1)。

IFP中的DG含量显著低于HM（P＜0.05），这可能对婴幼儿的脂质消化产生一定影响。IFP中含量最高的TG种类不仅与HM不同，且在不同脂质来源的IFP中也不同。这表明IFP虽然在主要脂肪酸的组成上接近了HM，但在整体的脂肪组成上仍与HM存在很大差异。

2.2 IFP与HM的甘油酯组成的差异分析

为进一步明确不同脂肪来源的IFP与HM在DG和TG组成上的差异，对表2中不同样品的DG和TG的组成进行了偏最小二乘判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）[23]，筛选不同消化产物中具有差异的脂肪种类，可以对不同脂肪来源的IFP与HM的甘油酯组成差异进行有效表征，分析结果如图1、2所示。

图1中所有样本点表现出明显的聚类趋势，且均分布在95%的置信区间内（图2），图1中无离群样本点，说明建立的PLS-DA模型有效地对30 个样品进行了分类，同时模型的R2X=0.671、R2Y=0.974、Q2=0.957，说明建立的PLS-DA模型稳定性较好，可对95.7%的原始数据进行解释并具有良好的预测性[23]。

图1 不同脂肪来源IFP及H?M甘油酯组成的PLS-DA模型得分图Fig. 1 PLS-DA score plot of glyceride composition in IFP with different fat sources and HM

图2 不同脂肪来源IFP及HM甘油酯PLS-DA模型Hotelling T2图Fig. 2 Hotelling T2 of PLS-DA model for glyceride composition in IFP with different fat sources and HM

由图1可知，HM与不同IFP形成了明显区分，因此不同脂肪来源的婴儿配方在甘油酯上均与HM存在不同。在IFP中，纯植物油脂基的IF1和IF2较为接近，并与添加了牛乳脂的IF3、IF4和IF5形成了明显不同的分布区域，这说明乳脂成分对配方奶粉的甘油酯组成影响十分明显。IF4在分布图中与IF1和IF2是较为接近的，因此IF4虽然同样含有牛乳脂成分，但含量可能低于IF3和IF5。

图3为不同脂肪来源IFP及HM胃相脂肪酸释放 PLS-DA模型的因子载荷图，离密集区越远的变量对分类起的作用越关键，为将这种对差异的贡献度量化，计算不同因素对模型的可变重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值，VIP值越大，对样本分类作出的贡献越大。VIP值大于1的变量在不同类别之间差异显著，对分类起重要作用[24-25]。

图3 不同脂肪来源IFP及HM甘油酯PLS-DA模型因子荷载图Fig. 3 Factor loading plot of PLS-DA model for glyceride composition in IFP with different fat sources and HM

对于VIP值大于1的甘油酯种类进行非参数检验中的Kruskal Wallis检验，验证这些甘油酯在不同样品中的显著差异（P＜0.05），最终筛选VIP值大于1且P值小于0.05的甘油酯种类作为不同组样品间具有差异的甘油酯种类。不同脂肪来源的IFP与HM的差异甘油酯种类结果见表3，其中具有显著差异的DG有5 种，TG有11 种。

不同脂肪来源IFP及HM中差异甘油酯种类Table 3 Differential glycerides between IFP with different fat sources and HM 表 3

通过绘制热图和层次聚类分析，对差异甘油酯在不同脂肪来源IFP及HM中的分布进行了表征。如图4所示，在DG方面，HM中具有显著较高DG(18∶2/18∶2)和DG(18∶1/18∶1)，而IFP中含量极少，这与HM中高C18:2和C18:1的趋势一致[26-27]；IF5中则有显著较高的DG(18∶0/18∶0)和DG(21∶0/22∶6)；而植物基IFP中则有相对较高的DG(22∶6/25∶0)。

图4 显著差异DG、TG在不同脂肪来源IFP及HM中的分布Fig. 4 Distribution of differential DG and TG between IFP with different fat sources and HM

在TG方面，HM具有TG(12∶0/12∶0/16∶0)、TG(16∶0/18∶0/18∶1)和TG(16∶0/18∶1/18∶1)显著较高的特点（P＜0.05），其中TG(16∶0/18∶1/18∶1)在HM中的主要存在形式为OPO[21,28]，其对改善婴幼儿便秘和钙利用具有重要意义[13]，虽然IF1、IF2、IF3和IF4均添加了OPO成分，但其含量仍显著低于HM（P＜0.05）。植物基的IF1和IF2则含有显著较高的TG(16∶0/16∶0/18∶1)（P＜0.05），这可能与二者较高的棕榈油添加量有关[29]。添加了乳脂的IF3、IF4和IF5则具有显著较高 （P＜0.05）的TG(16∶0/16∶0/16∶0)、TG(14∶0/16∶0/16∶0)、TG(16∶0/17∶0/18∶1)、TG(18∶1/18∶1/18∶2)和TG(12∶0/18∶1/16∶1)含量，这是添加了乳脂的IFP的共性特点。同时IF5中的TG(18∶2/18∶2/18∶2)显著高于其他样品（P＜0.05）而TG(16∶0/18∶1/18∶1)显著低于其他样品，这与IF5添加了较多大豆油而未添加OPO的趋势一致[30]。此外，IFP相比于HM均含有显著较高的TG(16∶1/17∶2/22∶6) （P＜0.05），这说明IFP中C22:6的存在形式可能与HM不同，而这可能与IFP中C22:6主要来源于海藻油或鱼油有关。

综上，IFP中OPO含量仍显著低于HM，且其C22:6存在形式与HM不同。在不同脂肪来源的IFP中，可根据是否添加牛乳脂形成较为清晰的聚类划分，说明IFP中牛乳脂的添加对其甘油酯组成的影响十分巨大，其中TG(16∶0/16∶0/16∶0)、TG(14∶0/16∶0/16∶0)、TG(16∶0/17∶0/18∶1)、TG(18∶1/18∶1/18∶2)和TG(12∶0/18∶1/16∶1)相对含量显著较高是添加了牛乳脂的配方奶粉的明显特征，而这可能会对婴儿胃肠道中脂肪的消化产生一定影响。

3 结 论

不同脂肪来源的IFP在脂肪组成上与HM存在显著差异，HM中DG相对含量高达（7.84±0.57）%，而IFP中DG相对含量不足2%，其中HM含量最高的DG种类为DG(18∶2/18∶2)和DG(18∶1/18∶1)，二者占HM中总DG的80%以上，这可能更加有利于婴幼儿对C18∶1和C18∶2的吸收和利用。在TG组成上，已添加OPO的IFP，其含量仍显著低于HM，同时IFP中TG(16∶1/17∶2/22∶6)含量显著高于HM，这说明IFP中C22∶6的主要存在形式与HM不同。此外，IFP中牛乳脂的添加会使其TG(16∶0/16∶0/16∶0)、TG(14∶0/16∶0/16∶0)、TG(16∶0/17∶0/18∶1)、TG(18∶1/18∶1/18∶2)和TG(12∶0/18∶1/16∶1)的相对含量显著提高，这可能会对婴儿胃肠道中脂肪的消化产生一定影响。