利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选

陈红全，王建瑛

1浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科，浙江 杭州 310016；2南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏 南京 211166

耐药性仍然是治愈癌症的主要限制因素，尽管多种化疗药物早期对肿瘤的治疗效果很好，但随着耐药性的产生，常导致癌症复发［1］，对肿瘤细胞耐药机制的研究有助于更好地治疗癌症。RNA 干扰技术（RNA interference，RNAi）曾被应用于肿瘤细胞耐药基因的筛选，但由于RNAi 不能完全抑制基因表达，而且存在广泛的脱靶效应，影响对基因功能的判定。CRISPR⁃Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）系统具有高效、便捷等诸多优点，为肿瘤细胞耐药性分子机制的解析提供了强大的工具［2］。

CRISPR⁃Cas 系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的免疫防御系统，用以对抗入侵的病毒及外源核酸［3］。目前，对Ⅱ类CRISPR⁃Cas系统中来源于酿脓链球菌的Streptococcus pyogenesCas9（sp⁃Cas9）研究最为深入，Cas9蛋白作为核酸内切酶，在引导RNA 的指导下识别目标DNA 序列后激活Cas9蛋白的酶切活性［4］。正是由于这种靶向功能，CRIS⁃PR/Cas9 系统已被广泛应用于多物种的基因编辑、基因调控、定位成像、细胞谱系追踪、高通量文库筛选以及病毒检测等领域［5］。目前该系统还存在诸多缺点，如Cas9表达载体过大，不容易被转染进细胞；Cas9载体长时间表达，会增加脱靶的风险［6］。因此，有必要构建一个可诱导表达Cas9的稳定细胞系，用以解决低效转染和因Cas9 长时间表达而导致高脱靶风险的问题。

慢病毒常被用于稳定细胞系的构建，但是需要包装病毒颗粒，费时费力，并存在感染的风险，本研究利用便捷的PiggyBac 转座子系统，成功构建了可诱导表达Cas9 的稳定HeLa 细胞系，并证明在多个位点可以高效切割基因组；同时，我们针对人核受体基因，设计了对应的sgRNA 文库，在这个细胞系上进行了抗癌药物顺铂（Cisplatin）耐药性的筛选，以期为顺铂耐药机制的解析打下基础。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T 和HeLa 细胞购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）；高糖DMEM（HyClone公司，美国），胎牛血清（FBS）（Gem⁃ini 公司，美国），青链霉素（Gibco 公司，美国）；Lipo⁃fectamine 2000（Invitrogen 公司，美国）；强力霉素（Sigma 公司，美国）；Zeocin（Invitrogen 公司，美国）；嘌呤霉素（Merck 公司，德国）；高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TaKaRa 公司，日本）；限制性内切酶BsaⅠ（NEB 公司，美国）；Esp3 Ⅰ（Fermentas公司，立陶宛）；多聚赖氨酸（Sigma 公司，美国）；T7EN1（NEB 公司，美国）；T 载体（TaKaRa 公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建

pST1374⁃NLS⁃Flag⁃Cas9、pST1374⁃NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS、pST1374⁃NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NP、pST1374⁃Cas9⁃NLS 和pST1374⁃Cas9⁃SP 改自pST1374⁃NLS⁃flag⁃linker⁃Cas9（Addgene 公司，美国）［7］。用于构建针对人RAG1基因的sgRNA表达载体通过寡聚核苷酸（oligo）在体外退火，利用BsaⅠ位点插入pGL3⁃U6⁃sgRNA⁃PGK⁃Puro 载体（Addgene 公司，美国）［7］，所用oligo 序列为hRag1⁃U6⁃Up：5′⁃CCGGTGTCT⁃GCTTTGATGGACA⁃3′；hRag1⁃U6⁃Down：5′⁃AAACT⁃GTCCATCAAAGCAGACA⁃3′。

用于高通量构建sgRNA 的表达载体pGL3⁃U6⁃ccdB⁃PGK⁃Puro 改自pGL3⁃U6⁃sgRNA⁃PGK⁃Puro 载体。以pGL3⁃U6⁃sgRNA⁃PGK⁃Puro 为模板，利用前向特异引物和共用反向引物扩增出19N⁃sgRNA backbone，通过Esp3Ⅰ酶切位点，插入pGL3⁃U6⁃ccdB⁃PGK⁃Puro 载体。用于构建sgRNA 文库的慢病毒载体pLKO.1⁃U6⁃ccdB⁃PGK⁃Puro 改自pGL3⁃U6⁃ccdB⁃PGK⁃Puro。

针对47个核受体基因各设计2条sgRNA（表1）。共用的反向引物为T7 gRNA Esp3I Rev：5′⁃TTA⁃CACCGTCTCGTTTATGCTTCCGGCTCGTATG⁃3′。

表1 构建sgRNA表达载体所用引物Table 1 Sequences of primers for constructing sgRNA expression vectors

（续表1）

PiggyBac 转座子系统由刘澎涛教授惠赠［8］。NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS 和Cas9⁃NLS 片段分别来自pST1374⁃NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS 和pST1374⁃Cas9⁃NLS，IRES⁃hrGFP 片段扩增自pShuttle⁃IRES⁃hrGFP（Agi⁃lent Technologies 公司，美国），Sv40 Pro⁃BleoR⁃pA 片段扩增自pcDNA3.1⁃Zeo载体，以上片段通过酶切位点克隆至PiggyBac 表达载体中，构建PB⁃TRE⁃NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo 和PB⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo载体。

1.2.2 细胞培养和转染

HEK293T 和HeLa 细胞培养于高糖DMEM，10%FBS，1%100×青链霉素中。

HEK293T 细胞利用Lipofectamine 2000 进行转染。在12孔板中，1 μg Cas9各载体和0.5 μg sgRNA载体被共转染到HEK293T中，72 h之后收集细胞用于下游分析。在24 孔板中，0.5 μg PB⁃TRE⁃NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo 和0.25 μg PB⁃CAG⁃rtTA载体被共转染到HEK293T中，24 h之后加入强力霉素（Dox）至2 μg/mL，72 h之后用于表达分析。

HeLa细胞利用电转（BioRad Gene Pulser XL）转染。4 μg PB⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo、2 μg PB⁃CAG⁃rtTA和2 μg转座酶载体被共电转到2×106个HeLa细胞中，48 h之后，加入100 μg/mL Zeocin筛选3 代，然后用于单克隆的生长和挑选。对于挑出来的稳定表达可诱导Cas9 的细胞株，电转2 μg sgRNA 表达载体，24 h 后加入Dox（2 μg/mL）和嘌呤霉素（1 μg/mL），72 h后收集细胞并提取DNA。

HeLa8E 克隆细胞经扩增后加入Dox，以诱导Cas9 的表达和对目标基因的编辑。分别加入0.3、0.9、1.5 μg/mL 顺铂处理细胞48 h，在对照细胞（未加Dox）全部死亡之后，撤掉顺铂。由于0.3 μg/mL的顺铂不能使对照细胞全部死亡，后续实验从0.9 μg/mL和1.5 μg/mL两组中挑选单克隆进行。

1.2.3 免疫荧光染色

HEK293T 细胞培养在包被了多聚赖氨酸的盖玻片上，转染72 h之后，细胞直接用于拍照，或者用4%的PFA（paraformaldehyde）室温固定15 min，PBS洗2 次，用含0.2%Triton 100 的PBS 处理5 min 以增加细胞膜的渗透性，然后用标准羊血清（武汉博士德公司）室温封闭30 min。用加抗⁃Flag M2（Sigma公司，美国）的封闭液室温孵育2 h。PBS 洗2 次后，将cy3⁃conjugated⁃goat⁃抗⁃mouse IgG（Jackson Immuno⁃Research 公司，美国）二抗和Hoechst 33258（Sigma公司，美国）加入PBS，并室温孵育细胞1 h，PBS 洗3 次后用Vectashield Mounting medium（Vector Laborato⁃ries 公司，日本）进行封片。所有免疫荧光图片用Olympus Flueview 1000 激光共聚焦显微镜拍摄。

1.2.4 T7EN1切割检测

收集的细胞用裂解液（10 μmol/L Tris⁃HCl，0.4 mol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1% SDS，100 μg/mL Proteinase K）在58 ℃水浴锅中消化过夜，用酚氯仿抽提裂解物，然后用乙醇沉淀得到DNA。目的DNA片段通过PCR 从基因组中扩增出，PCR 产物用PCR cleanup kit（Axygen 公司，美国）纯化，吸取200 ng 纯化后的PCR 产物，在20 μL 的1×NEBuffer 2（NEB 公司，美国）体系中退火，退火程序为95 ℃5 min；95 ℃～85 ℃，每秒降低1 ℃；85 ℃～25 ℃，每秒降0.1 ℃；4 ℃保持。退火后的PCR 产物用0.5 μL T7EN1 在37 ℃水浴锅中处理30 min，然后在2.5%的琼脂糖凝胶中电泳。利用Image J 软件对凝胶电泳图片进行光密度定量分析，采用之前报道的公式计算切割效率［9］，公式如下：切割效率=。a、b代表被切割片段的光密度值，c 代表未被切割片段的光密度值，对于需要TA 克隆和测序的样品，PCR产物克隆进T载体，挑取阳性克隆用M13⁃47通用引物测序。

PCR扩增引物hRAG1⁃For：5′⁃GTGAAAGCCAT⁃CACAGGGAGAC⁃3′，hRAG1⁃Rev：5′⁃AGAATGCCT⁃CCCAGCTCAAGC⁃3′，扩增产物大小为623 bp；hERb lib⁃testF：5′⁃CTTCCTCCTACAACTGCAGTCAA⁃3′，hERb lib⁃testR：5′⁃CGCAATCGTGCCATTATACT⁃CCA⁃3′，扩增产物大小为656 bp；hERRa lib⁃testF：5′⁃GCATTGAGCCTCTCTACATCAAG⁃3′，hERRa lib⁃tes⁃tR：5′⁃GGTACCCTGAACTCACTCACATC⁃3′，扩增产物大小为522 bp；hERRb lib⁃testF：5′⁃GACTTCCC⁃GATTTGTGTCCACAG⁃3′，hERRb lib⁃testR：5′⁃CT⁃GTCCAGTGCCAGAATGAGAAG⁃3′，扩增产物大小为609 bp；hERRg lib⁃testF：5′⁃CACTACAGGACAGAC⁃GCTTCATT⁃3′，hERRg lib⁃testR：5′⁃CTCGTTAGCT⁃TACACTGGCAGTA⁃3′，扩增产物大小为684 bp。

1.2.5 顺铂耐药克隆sgRNA 序列测定和目标基因验证

顺铂耐药克隆sgRNA 序列扩增引物为pGL3 to PLKO Cla1 For：5′⁃CTCGACGGTATCGATCACGAG⁃AC⁃3′，U6 array seq Rev⁃new：5′⁃CTGCCATTTGTCT⁃CGAGGTCGAG⁃3′，扩增产物大小为549 bp，利用pGL3 to PLKO Cla1 For引物进行测序。VDR基因编辑位点扩增引物为hVDR lib⁃testF：5′⁃GCTGAAG⁃CAGGAGGATTACTTGA⁃3′，hVDR lib⁃testR：5′⁃GA⁃CACCAACACACAGATCCTCAA⁃3′，扩增产物大小为717 bp，利用hVDR lib⁃testF引物进行测序。

1.3 统计学方法

实验数据利用GraphPad Prism 7.0统计分析，数据以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，使用Tukey 检验进行两组比较，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 可诱导表达Cas9载体的构建和验证

来自不同实验室的Cas9 载体各不相同，有的NLS放置在Cas9的一端［10-11］，有的放置在两端［9］，有的利用了不同的NLS 序列［9，11］，密码子优化的规则也各不相同［9-12］。我们将不同版本的Cas9 和PGL3⁃U6⁃Rag1⁃sgRNA转染HEK293T细胞，利用T7EN1酶切来检测不同版本Cas9 的切割效率。结果显示，NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS 和Cas9⁃NLS 具有相对较高的切割效率，光密度定量分析也得出一致的结果，但不同Cas9版本之间的切割效率差异无统计学意义（图1A、B）。我们选择NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS 和Cas9⁃NLS这2 个版本的Cas9 进行PiggyBac 转座子载体的构建，通过连接IRES⁃hrGFP 来指示Cas9 的表达情况，通过连接BleoR 抗性基因，利用Zeocin 药筛来获得稳定插入Cas9 的细胞（图1C）。在瞬时共转染PB⁃TRE⁃NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS 和PB⁃CAG⁃rtTA 的HEK293T 细胞中加入Dox，可以成功诱导hrGFP 的表达，而未加入Dox 的对照组中未见阳性信号（图1D）。为了进一步检测Cas9是否表达，我们利用an⁃ti⁃Flag抗体进行染色，结果显示GFP阳性的细胞，同时也是Flag 阳性的，并且Flag 信号定位在细胞核中（图1E），说明Cas9 蛋白成功表达和定位。有趣的是，Flag 染色结果显示Cas9 蛋白在核仁中富集，这和之前报道的现象一致［7］，最近的研究表明，Cas9含有核仁定位信号，突变核仁定位信号会导致Cas9蛋白均匀分布在细胞核中，但是其切割效率也会随之降低［13］。

图1 可诱导表达Cas9载体的构建和验证Figure 1 Construction and verification of inducible Cas9 expression vector

2.2 可诱导表达Cas9的稳定细胞系的构建和验证

为了提高转座效率，我们使用插入片段较小的PB⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo 载体构建可诱导表达Cas9 的稳定细胞系。PiggyBac 转座子载体、PB⁃CAG⁃rtTA 和转座酶载体共电转，加入Zeocin 传代3次之后，挑选圆形的单克隆接种到96孔细胞板中继续培养，加入Dox 之后，在荧光显微镜下挑选GFP 阳性的克隆，共挑出7 个GFP 信号较强的克隆（1A、1G、2B、3G、5H、8E、10A）继续培养（图2A）。为了挑选效率最高的细胞系，我们在这7 个细胞株中电转了PGL3⁃U6⁃Rag1⁃sgRNA，PCR扩增目的片段并进行T7EN1酶切，结果显示8E克隆具有较高的切割效果（图2A）。为了进一步检测切割效率，我们将PCR 产物进行了TA 克隆并测序，在17 个成功测序克隆中检测到15 个克隆含有突变，效率高达88.2%（15/17），其中76.5%（13/17）的克隆发生了碱基缺失，11.8%（2/17）的克隆同时发生了缺失和插入（图2B），这些结果说明我们成功构建了可诱导表达Cas9的稳定细胞系。

图2 可诱导表达Cas9的稳定细胞系的构建和验证Figure 2 Generation and verification of a stable HeLa cell line with inducible expression of Cas9

为了检测HeLa 8E细胞株在其他基因位点的基因编辑效果，我们针对人ERb、ERRa、ERRb和ERRg 4 个基因设计相应的sgRNA，并检测切割效率。传统的sgRNA 表达载体构建依赖oligo 的退火然后连接到载体中，无法进行sgRNA表达载体的高通量构建，为了能在HeLa 8E细胞上进行高通量筛选，我们将sgRNA识别序列设计在前向引物上，以sgRNA的骨架为模板，和公共后向引物扩增出携带完整sgRNA 序列的片段，利用二类限制性内切酶Esp3Ⅰ和T4 DNA连接酶，通过边切边连的方式，可以高通量地构建sgRNA 表达载体（图2C）。我们利用这种方法一次性构建了8 条sgRNA 表达载体，针对每个基因，等质量混合2 条sgRNA 载体，并电转HeLa 8E细胞系，PCR 扩增结果显示每个基因都出现了明显的片段缺失（图2D）。以上结果证明我们构建的可诱导表达Cas9 的稳定细胞系没有编辑位点的偏好性，可以在多个基因位点进行高效基因编辑，为下一步用于高通量sgRNA文库筛选打下了很好的基础。

2.3 顺铂耐药性核受体基因的筛选

顺铂是一种含铂的抗癌药物，对恶性上皮肿瘤、淋巴瘤等都有治疗功效，长期使用这种药物会导致人体产生耐药性，但是耐药机制仍存在争议［1］。核受体超家族是配体激活的转录因子，共含有48个基因，在细胞分化、增殖和代谢中发挥不同作用，参与多种癌症的发生、发展［14］。核受体是重要的药物靶点，阻断乳腺癌患者雌激素受体（ERa）作用的药物或阻断前列腺癌患者雄激素受体（AR）作用的药物显著改善了患者的生存，但也伴随着严重的药物耐药性［14］。为了探究核受体超家族成员是否参与顺铂耐药性的发生，我们针对目前鉴定的47个人类核受体基因（由于HeLa 细胞不表达ERa［15］，所以排除此基因），设计了94 条sgRNA，组成了一个小型的sgRNA 文库（图3A），包装成病毒颗粒之后感染HeLa 8E 细胞，利用嘌呤霉素筛选整合进sgRNA 载体的细胞。在开始顺铂耐药性实验前48 h，加入Dox以诱导Cas9的表达和对目标基因的编辑。我们设计了3 个顺铂浓度梯度，在对照细胞全部死亡之后，撤掉顺铂。从0.9 μg/mL 和1.5 μg/mL 两组中共长出37 个单克隆（图3B），挑选每个单克隆并扩增培养，提取基因组DNA之后PCR扩增包含sgRNA的序列，Sanger 测序结果发现21 个克隆含有维生素D受体（vitamin D3 receptor，VDR）sgRNA，2 个克隆含有维甲酸受体β（retinoic acid receptor beta，RARb）sgRNA，含有视黄醇X 受体（retinoid x receptor beta，RXRb）和类固醇生成因子⁃1（nuclear receptor 5A1，NR5A1）sgRNA 各有1 个克隆（图3C），剩下12 个克隆sgRNA 位点显示乱峰，无法确定具体是哪个sgRNA。为了进一步验证目标基因是否被编辑，我们对21个含有VDR sgRNA单克隆的VDR区域进行了测序，结果显示20个克隆的sgRNA识别区域发生了突变（图3D）。

图3 顺铂耐药性核受体基因的筛选Figure 3 Screening of cisplatin⁃resistant nuclear receptor genes

3 讨论

本研究利用PiggyBac 转座子系统，成功构建了可诱导表达Cas9 的稳定HeLa 细胞系，并证明在多个位点可以高效切割基因组。同时，我们针对人核受体基因构建了sgRNA文库，在这个细胞系上进行了顺铂耐药性的筛选。之前有研究表明，PiggyBac转座子在转座酶存在的情况下会发生再转座或者丢失的现象［16］，为了防止这种情况的出现，我们转座酶是瞬时表达的，不会持续性存在；同时，在培养HeLa 8E 细胞株的过程中，也会定期加上Zeocin 进行药筛，以排除Cas9丢失和被沉默的可能。除了通过诱导控制Cas9 的表达，Cas9 切口酶/双sgRNA［7］、截短sgRNA［17］、高保真Cas9 突变体［18-23］等策略也用于降低CRISPR/Cas9的脱靶效应。另外，多个比sp⁃Cas9小的同系物如saCas9［24］、Cpf1［25］等也被发现，一定程度上解决了转导效率低的问题。关于Cas9 在核仁中富集，之前的研究表明，一旦表达sgRNA，Cas9 会均匀分布在细胞核中［7］，这种现象是很难用Cas9 含有核仁定位信号来解释的［13］，可能是由于Cas9/sgRNA复合体的溶解性更好，亦有可能是其他机制导致，值得进一步的研究。

之前有文章报道核受体基因ERb 的激动剂可以调节胶质母细胞瘤细胞对顺铂的敏感性［14］，鼓励我们去探究核受体超家族成员与顺铂耐药性的关系。在筛选的过程中，由于含有RARb、RXRb 和NR5A1 sgRNA的克隆较少，我们没有进一步去验证对应的基因是否被编辑，以及有12个克隆含有多个sgRNA，也没有进一步去验证具体是哪些基因被编辑，这些都值得继续探索。20 个含有VDR sgRNA克隆的测序结果显示，所有单克隆都携带相同的突变，提示这20 个单克隆可能来源于同一个细胞，之前有文章报道维生素D3及其受体VDR调控机体的钙磷代谢稳态，对多种肿瘤细胞的增殖有抑制作用。因此，突变VDR 可能会使HeLa 8E细胞的增殖加快，导致长出的克隆大部分含有VDR突变，当然，这也可能是顺铂耐药性发生的原因，需要进一步通过直接敲除或者过表达VDR进行正反验证，具体的机制也值得我们深入去解析。