丙泊酚介导miR- 637/STAT3轴调控肝癌细胞生长的相关机制研究

张琦，孙鹏，郭阳，谷月舜

(1.阳谷县人民医院 麻醉科，山东 聊城 252300； 2.阳谷县人民医院 普外科，山东 聊城 252300；3.聊城市人民医院 神经内科，山东 聊城 252000)

全球范围内，肝癌的病死率占所有恶性肿瘤疾病的第3位，尽管近年来肝癌的早期诊断和治疗技术有一定的进步，但肝癌患者预后并不乐观，术后转移率和复发率仍处于较高水平[1]。因此，探究肝癌转移和复发机制，将对靶向治疗药物的开发有重要意义。丙泊酚是临床常用的静脉麻醉药物，可用于肿瘤根治术的全身麻醉，据报道，丙泊酚对肝癌[2]、胃癌[3]、子宫内膜癌[4]等多种恶性肿瘤均具有抑制作用。周桥灵等[5]研究发现，丙泊酚可抑制人肝癌HepG2细胞的侵袭，可能与抑制磷脂酰肌醇3- 激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路的激活有关。但丙泊酚在肝癌中是否还有其他的作用途径尚不明确。本研究通过探究丙泊酚对肝癌细胞生长的影响及其分子机制，以期为肝癌的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

人肝癌HepG2细胞株购自上海细胞生物医学研究所。

1.2 药品与主要试剂

丙泊酚注射液(北京费森尤斯卡比医药有限公司，国药准字J20171055，规格为每支20 ml)，细胞计数试剂盒- 8(cell counting kit- 8，CCK- 8)、蛋白质定量试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)，磷脂结合蛋白V- 异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(annexin V- fluorescein Isothiocyanate/ propidium iodide，Annexin V- FITC/PI)凋亡试剂盒(南京建成生物工程研究所)，基质胶、转移小室(美国BD)，切割后天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase- 3，ab214430)、B淋巴细胞肿瘤- 2(B- cell lymphoma- 2，Bcl- 2，ab196495)、Bcl- 2相关蛋白X(Bcl2- associated X,Bax，ab3191)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)- 2(ab92536)、MMP- 9(ab228402)、信号转导及转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3，ab119352)、磷酸化STAT3(STAT3 phosphorylation，p- STAT3，ab76315)蛋白抗体(美国Abcam)，Trizol试剂(美国Invitrogen)，荧光定量试剂盒(日本TaKaRa)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与分组 用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基混匀HepG2细胞，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔天采用0.25%胰蛋白酶液消化细胞，按1∶2的比例进行传代培养。密切观察细胞生长状态，取对数生长期细胞随机分为对照组和丙泊酚低、中、高剂量处理组，对照组添加正常培养基，丙泊酚处理组分别添加10、25、50 μg·ml-1丙泊酚[6]，处理后置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养。

1.3.2 细胞增殖能力测定 各组细胞接种96孔板，处理结束后分别培养24、48、72 h，添加CCK- 8试剂继续培养4 h，经iMark酶标仪(美国RioRad)检测570 nm处光密度(OD)值，计算细胞增殖抑制率[=(1-OD丙泊酚处理组)/OD对照组×100%]。

1.3.3 细胞凋亡测定 收集各组处理后细胞，调整浓度至1×106个·ml-1，加入结合缓冲液重悬细胞，混匀后分别加入AnnexinV- FITC、PI染液，4 ℃避光条件下孵育30 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3.4 细胞侵袭能力测定 预先将基质胶铺于转移小室上室，凝固后添加处理后的细胞(无血清培养基)，下室添加含有20%胎牛血清的培养基，正常条件培养24 h。将转移小室固定于4%多聚甲醛中，再经结晶紫染色10 min，用棉签轻轻拭去上室细胞，光镜(日本Olympus)下计数并拍摄下室细胞。

1.3.5 细胞迁移能力测定 收集各组处理后细胞铺于6孔板，待细胞贴壁后，用1 ml枪头于培养孔中线垂直划线，洗去脱落细胞继续培养，于0、24 h时拍照记录，以细胞划痕修复速度表示迁移率[=(划痕距离24 h-划痕距离0 h)/划痕距离0 h×100%]。

1.3.6 细胞中相关蛋白表达测定 收集各组处理后细胞，加入蛋白裂解液提取总蛋白，经蛋白质定量试剂盒检测蛋白浓度后，各组取等量蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将凝胶切成合适大小转移至PVDF膜，置于5%脱脂奶粉中封闭非特异性位点，分别加入1∶1 000稀释的蛋白一抗，4 ℃孵育过夜，再加入1∶10 000稀释的蛋白二抗，37 ℃孵育40 min，最后进行化学发光显示蛋白条带，以目的蛋白条带灰度值与甘油醛- 3- 磷酸脱氢酶(glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase, GAPDH)条带灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。

1.3.7 细胞中miR- 637表达测定 收集各组处理后细胞，加入Trizol试剂提取总RNA，经微量核酸仪检测样品RNA纯度和浓度，逆转录为cDNA链，参照荧光定量试剂盒配制反应体系，反应条件为95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共38个循环，miR- 637相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。miR- 637上游引物序列5′- ACUGGGGGCUUUCGGGCUCUGCGU- 3′，下游引物序列5′- ACGCAGAGCCCGAAAGCCCCCAGU- 3′；U6上游引物序列5′- CGCTTCGGCAGCACATATTAC- 3′，下游引物序列5′- TTCACGAATTTGCGTGTCCAT- 3′[7]。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 细胞增殖情况

随着细胞培养时间的延长，各组细胞的增殖抑制率均逐渐升高。同一培养时间点，丙泊酚处理组细胞增殖抑制率较对照组升高(P<0.05)，且不同剂量丙泊酚处理组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组HepG2细胞增殖抑制率的比较

2.2 细胞凋亡情况

如图1，对照组和丙泊酚低、中、高剂量处理组细胞凋亡率分别为(0.35±0.11)%和(4.21±0.62)%、(9.48±2.35)%、(19.47±4.17)%，各组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(F=58.941，P<0.001)。丙泊酚处理组细胞增殖抑制率较对照组升高(P<0.05)，不同剂量丙泊酚处理组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组HepG2细胞凋亡情况

2.3 细胞侵袭与迁移情况

丙泊酚处理组侵袭细胞数和迁移率较对照组降低(P<0.05)，且不同剂量丙泊酚处理组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、表2。

表2 各组HepG2细胞侵袭细胞数和迁移率的比较

图2 各组HepG2细胞侵袭与迁移情况 A.各组HepG2细胞侵袭情况(×400)； B.各组HepG2细胞迁移情况

2.4 细胞凋亡、侵袭及迁移相关蛋白的表达

丙泊酚处理组中cleaved caspase- 3表达较对照组升高，Bcl- 2/Bax、MMP- 2及MMP- 9水平较对照组降低(P<0.05)，且不同剂量丙泊酚处理组间cleaved caspase- 3、Bcl- 2/Bax、MMP- 2及MMP- 9水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、表3。

1、2、3、4依次为对照组及丙泊酚低、中、高剂量处理组

2.5 细胞中miR- 637/STAT3表达情况

丙泊酚处理组细胞中miR- 637表达较对照组升高，p- STAT3/STAT3水平较对照组降低(P<0.05)，且不同剂量丙泊酚处理组间miR- 637、p- STAT3/STAT3水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图4、表4。

1、2、3、4依次为对照组及丙泊酚低、中、高剂量处理组

表4 各组HepG2细胞中miR- 637/STAT3表达的比较

3 讨 论

近期研究显示，丙泊酚在调节围手术期免疫与肿瘤的相互作用中有重要作用，可延长各种类型肿瘤患者的生存时间[8]。Yu等[9]研究发现，丙泊酚可促进miR- 328表达，抑制去整合素金属蛋白酶8的表达，从而抑制胰腺癌细胞的增殖和转移。维持长期增殖和运动能力是癌细胞最根本的特性，本研究以HepG2细胞为研究对象，检测了丙泊酚对HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响，结果显示，丙泊酚可显著抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞的凋亡。Sun等[10]研究也显示，丙泊酚可调控肝细胞癌细胞的生长与转移。

细胞凋亡是细胞自主死亡过程，涉及凋亡诱导因子和凋亡抑制因子等调节因子的相互作用，对维持机体生长发育、细胞分化及病理生理状态有重要作用。正常情况下，细胞线粒体中Bcl- 2与Bax结合形成二聚体抑制细胞调亡；当受到外界刺激后，Bax水平升高形成更多的二聚体，聚集于线粒体膜增加其通透性，致使多种凋亡因子进入细胞质，激活caspase级联反应，最终导致细胞凋亡[11]。MMP- 2和MMP- 9是MMPs家族中降解Ⅳ型胶原主要的酶类，具有降解细胞外基质和基膜、促进新生血管生成、调节细胞间黏附作用等作用，可参与肿瘤细胞的侵袭与迁移的调控[12]。研究报道，肝癌中MMP- 2和MMP- 9表达升高，其表达水平与肝癌的发生及侵袭转移机制有关，抑制其表达可显著降低肝癌细胞的运动能力[13]。Kang等[14]应用丙泊酚处理MA- 10小鼠间质瘤细胞，结果显示，丙泊酚可能通过激活caspase通路，抑制MA- 10细胞中蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路，从而诱导其凋亡。吴悠等[15]研究发现，丙泊酚可下调转化生长因子β1，下调MMP- 9水平，抑制乳腺癌细胞MCF- 7细胞迁移和侵袭能力。本研究结果表明，丙泊酚可上调cleaved caspase- 3表达，下调Bcl- 2/Bax、MMP- 2和MMP- 9表达，诱导HepG2细胞凋亡，并抑制其侵袭与迁移。

miRNAs通过碱基互补配对与靶基因信使RNA的3′- UTR结合，介导靶基因的表达，从而在肿瘤的增殖、转移和对药物的敏感程度中起调控作用。据报道，miR- 637在肝癌、甲状腺癌中表达下调，miR- 637过表达可抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为[16- 17]。STATs是一类细胞质转录因子，可调节相关基因的转录，从而参与细胞的增殖、分化、炎症反应及免疫反应等过程[18]。STAT3作为STATs成员，可促进细胞持续性增殖，在恶性肿瘤中呈过度或持续激活状态。Huang等[19]研究显示，STAT3是miR- 637的靶基因，在骨肉瘤细胞的转移机制中有重要作用。Li等[20]研究发现，丙泊酚可介导EGFR/JAK2/ STAT3通路，增强顺铂诱导的宫颈癌细胞凋亡。本研究结果显示，采用丙泊酚处理后，细胞中miR- 637水平上调，STAT3磷酸化水平下调，提示丙泊酚可能介导miR- 637/STAT3轴，抑制肝癌细胞的生长与转移。

综上所述，丙泊酚可介导miR- 637/STAT3轴，抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与迁移，并诱导其凋亡。但本研究仅在细胞水平检测丙泊酚的作用，后期考虑选用动物模型，深入分析丙泊酚在肝癌中的作用。