PCSK9基因多态性与急性缺血性脑卒中患者发病风险及阿托伐他汀降脂作用的关系

邹佳，潘雪，杨涌涛

(重庆市第五人民医院 神经内科，重庆 400000)

在中国，急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点。目前针对脂质代谢功能障碍机制的治疗，尤其是降低低密度脂蛋白(LDL)水平，可以有效改善患者预后[1]。阿托伐他汀是一种广泛使用的降脂类药物，具有较好的安全性和耐受性，然而AIS患者对他汀类药物的治疗反应差异较大。全基因组关联分析研究表明，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)不仅与血脂水平有关，还与他汀类药物的治疗效果有关。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/溶菌素- 9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是近年来发现的影响胆固醇稳态的主要因子，其机制可能与LDL相关受体(LDLR)的降解有关，也可能与神经发育有关[2]。而且有研究发现，PCSK9编码区的罕见突变和常见变异都可能影响血浆LDL水平和中风风险[3]。然而PCSK9 SNPs是否会影响阿托伐他汀的治疗效果尚不清楚，本研究旨在分析PCSK9基因多态性检测对阿托伐他汀降低AIS患者血脂水平作用的影响，以期为临床精准医疗提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

从我院神经内科招募AIS患者119例，平均年龄(61.29±12.91)岁，所有患者均于2018年6月至2020年7月期间接受治疗。纳入标准：(1) 根据临床表现、脑部磁共振成像(MRI)和(或)头颅X线计算机断层扫描(CT)诊断为AIS；(2) 首次发病时间<72 h，过去2周内无抗血小板、抗凝和溶栓治疗史；(3) 有颈动脉超声检查和经颅多普勒检查数据；(4) 汉族人群，在本地居住超过10年。排除标准：有颅内出血/中风史，高血压，蛛网膜下腔出血，脑血管畸形，恶性肿瘤，动脉瘤，脑部手术史或创伤史，感染性疾病，自身免疫性疾病，严重心脏、肾脏或肝脏疾病。有任何阿托伐他汀过敏反应迹象的患者也被排除在外。所有患者都进行全身检查、缺血性脑血管事件评估、用药史询问，以及MRI、颈动脉超声检查和经胸超声心动图检查。另外纳入同期在我院进行健康体检的120例非心脑血管疾病者作为对照组，平均年龄(61.84±11.65)岁。纳入标准：(1) 无已知脑血管疾病家族史；(2) 心肺检查和神经系统检查未发现异常；(3) sMRI检查排除脑血管疾病。排除合并急性或慢性感染、恶性肿瘤、自身免疫性疾病者。本研究方案经医院伦理委员会批准，且患者均签署了知情同意书。所有患者每天口服阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司，国药准字H20051408，规格为每片20 mg)，每次20 mg，每天1次，共3个月。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集所有患者一般临床资料包括年龄、性别、种族、体质指数(BMI)、高危因素[吸烟史(平均吸烟天数≥1 d、吸烟时间>1年定义为吸烟)、饮酒史(平均每周饮酒3次、每次超过50 g定义为饮酒)、高血压、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病]，以及体格检查(身高、体重、血压、心率、体温)、特殊检查(心电图、颈动脉超声、血常规、血糖、血脂)结果。

1.2.2 实验室检测 分别于治疗前后采集两组患者10 ml清晨空腹静脉血，采用全自动生化仪检测患者血脂包括甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL- C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL- C)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)水平。另外采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法(试剂盒购自上海抚生实业有限公司)检测患者血清PCSK9水平。

1.2.3 PCSK9基因多态性检测 抽取5 ml空腹静脉血液样本置于乙二胺四乙酸(EDTA)管中，3 000 r·min-1离心5 min分离血浆。用标准酚- 氯仿法从外周血白细胞中提取基因组DNA，保存在-80 ℃，然后将基因组DNA样本稀释到50 ng·μl-1。使用Haploview 4.2软件和HapMap- 人类基因组单倍型图谱数据库，以次等位基因频率(minor allele frequency，MAF)≤0.01和连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)R2≥0.5作为阈值，筛选PCSK9基因3个SNPs基因型。采用单碱基延伸反应法(single- base terminal extension，SNaPshot)进行基因分型。将4.0 μl PCR产物与2- U碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)和2- U核酸外切酶Ⅰ(exonuclease Ⅰ，ExoⅠ)在37 ℃孵育60 min。经15 min酶灭活培养，将1 μl消化PCR产物与5 μl预反应混合物、1 μl引物和3 μl dH2O2混合。将该混合物置于热循环仪中，经96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s后，加入0.5 U SAP，反应混合物孵育60 min。加入10 μl甲酰胺并95 ℃加热5 min后，用ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪进行测序。

1.3 统计学处理

使用SPSS 26.0软件处理所得数据。计量资料用均值±标准差表示，采用t检验和重复测量的方差分析，若存在组间×时间交互效应，则进一步进行单独效应分析；计数资料以例及百分比表示，采用卡方检验；采用单因素和多因素Logistic回归模型分析与AIS发生相关的临床因素。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 对照组与AIS组PCSK9基因型及等位基因型分布比较

如表1所示，对照组与AIS组SNP1(rs562556)、SNP2(rs2479408)、SNP3(rs529787)基因型及等位基因分布差异具有统计学意义(P<0.05)，AIS组A及C等位基因型频率较对照组更高。

表1 对照组与AIS组SNP1(rs562556)、SNP2(rs2479408)、SNP3(rs529787)基因型及等位基因型分布比较

2.2 PCSK9基因连锁不平衡性分析

表2显示了PCSK9基因的连锁不平衡模式，以及它们的|D′|和R2值。|D′|值0.7～1表示在一对SNPs之间有很强的LD，|D′|值0.25～0.7表示中等LD，|D′|值0～0.25表示低LD。结果显示，SNP1和SNP2的|D′|>0.7，具有强LD；SNP2和SNP3的R2值>0.5意味着SNP2和SNP3可以相互替换，它们不能同时构建单体型。SNP1和SNP2位于PCSK9基因外显子9区域，SNP3位于内含子3区域，因此在进行多因素分析时只纳入了SNP1和SNP2基因型。

表2 AIS组患者PCSK9基因连锁不平衡性分析

2.3 单因素和多因素Logistic回归分析PCSK9基因型与AIS发生的关系

经单因素和多因素Logistic回归分析，吸烟史、高血压史、慢性阻塞性肺疾病史、rs562556基因多态性分布都与AIS的发生风险密切相关(P<0.05)，见表3。

表3 单因素和多因素Logistic回归分析与AIS发生相关的因素

2.4 不同rs562556基因型AIS患者一般临床资料比较

如表4所示，不同rs562556基因型的两组(GG组与AG+AA组)患者年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、高血压病史、糖尿病史、慢性阻塞性肺疾病史等资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表4 不同单倍体分型AIS患者一般临床资料比较

2.5 不同rs562556基因型对阿托伐他汀降脂效果的影响

如表5所示，经重复测量的方差分析，血TC、TG、LDL- C及PCSK9水平随治疗时间不断波动变化，治疗前后水平存在差异，这种波动变化可能与rs562556基因型有关。(1) 时间效应：GG组及AG+AA组患者在不同检测时间点时血TC、TG、LDL- C、PCSK9水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(2) 组间效应：GG组与AG+AA组间血TC、TG、LDL- C、PCSK9水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(3) 组间×时间交互效应：AG+AA组患者血TC、TG、LDL- C水平较GG组波动范围小，而PCSK9水平波动范围更大(P<0.05)。其他血脂指标包括HDL- C、ApoA1、ApoB水平在整个监测时间点和组间不存在交互作用(P>0.05)。单独效应分析显示：治疗前，AG+AA组患者血TG、LDL- C水平高于GG组患者，PCSK9水平低于GG组患者(P<0.05)；治疗后，两组血TC、TG、LDL- C水平较治疗前均降低，同时PCSK9水平升高(P<0.05)；且AG+AA组患者治疗后血TC、TG、LDL- C水平低于GG组，同时PCSK9水平高于GG组(P<0.05)。

表5 不同rs562556基因型对阿托伐他汀降脂效果的影响

3 讨 论

PCSK9是前蛋白转化酶家族的第9个成员[4]，作为一种丝氨酸蛋白酶和分子伴侣，PCSK9通过内涵体/溶酶体途径降低肝脏或肝外的LDLR水平，并增加血浆LDL- C水平，另外PCSK9还可调节ApoB的合成和分泌[5]。例如PCSK9的“功能增强”错义突变与常染色体显性高胆固醇血症有关，而“功能丧失”的PCSK9无义突变与低LDL- C水平及降低心血管疾病的发病风险有关[6]。一些体内或体外研究也证实，PCSK9编码区的罕见突变和常见变异(如rs529787、E670G等)都会影响血浆LDL水平和AIS发病风险[7- 8]。在本研究中我们发现，SNP1(rs562556)、SNP2(rs2479408)、SNP3(rs529787)基因型及等位基因分布在AIS患者与对照组间存在差异:对SNP1(rs562556)，AIS患者A等位基因频率高于对照组(49.16%vs39.17%，P=0.008)；对SNP2(rs2479408)和SNP3(rs529787)，AIS患者C等位基因频率亦高于对照组。表明随着rs562556基因A等位基因频率的增加或rs2479408/rs529787基因C等位基因频率的增加，AIS发生风险也相应增加。在调整了性别、年龄、疾病史等因素后，rs562556基因多态性分布与AIS的发生风险密切相关，说明rs562556基因显性模型(GGvsAG+AA)可以增加AIS的发病风险。

动脉粥样硬化是缺血性脑卒中的常见危险因素之一，与脂质代谢密切相关[8]，因此降脂治疗是临床上治疗或预防AIS最常用的策略。阿托伐他汀是最有效的降脂药物之一，可降低血清TC、TG和LDL- C水平，提高血清HDL- C水平[9]。并且大量研究和临床实践证实，阿托伐他汀通过降低血脂水平、缩小颈动脉斑块面积和血管狭窄程度，可显著降低冠心病缺血性脑卒中的发病风险，有利于缩短AIS患者的治疗时间，改善患者预后[10]。此外，梁赋等[11]发现，瑞舒伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀3种药物均可有效降低大动脉粥样硬化型觉醒型卒中患者的血脂水平，同时也会明显提高血清PCSK9水平，这对降脂效果有一定的负面作用，因此对大动脉粥样硬化型觉醒型卒中患者，临床建议使用他汀类药物联合PCSK9抑制剂的方案，阿托伐他汀是其中一种药效同时受遗传因素和环境因素影响的药物。一些荟萃分析证实，即使症状相似，AIS患者使用阿托伐他汀的有效性也存在差异，这表明基因多态性可能是影响药物降脂作用的重要影响因素[12]。本研究结果显示，经阿托伐他汀治疗后，AIS患者血清PSCK9水平显著升高，而且rs562556位点AG+AA基因型患者血清PSCK9水平升高更明显，同时这部分患者血脂降低程度也小于GG组患者，说明rs562556位点AG+AA基因型可能是影响阿托伐他汀降脂作用的重要原因。PCSK9基因外显子9区域rs562556突变变异位于催化结构域和C末端结构域之间的连接结构域，被认为属于功能增强突变[13]，其错义突变与颈动脉粥样硬化斑块、LDL- C和PCSK9水平独立相关[14]。本研究数据也显示，GG组患者血清PCSK9水平升高程度小于AG+AA组患者，这可能是影响阿托伐他汀降脂作用的重要原因之一。

综上，rs562556基因显性模型(GGvsAG+AA)可以增加汉族人群AIS的发病风险；同时这也可能是影响阿托伐他汀用于AIS患者降脂治疗作用的重要因素，携带A等位基因者经阿托伐他汀治疗后血清PCSK9水平升高明显，这对于其降脂作用有一定的负面影响。未来有待更大的样本量来进一步验证我们的发现。