黑豆中植酸提取工艺

时宁宁，阮长青，李志江，张东杰

1.黑龙江八一农垦大学食品学院（大庆 163319）；2.黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室（大庆 163319）；3.国家杂粮工程技术研究中心（大庆 163319）；4.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心（大庆 163319）

黑豆为双子叶植物纲豆科大豆属植物的黑色种子，此类植物耐干旱、耐贫瘠，而且营养物质含量丰富，主要产地分布于我国东北、山西、河北等地[1-2]。黑豆素称“植物蛋白之王”，蛋白质含量普遍高于其他豆类，并且其血糖生成指数较低，除此之外植物黑豆皮色素的主要成分是花色苷，其总酚含量及其抗氧化活性均显著高于黄豆[3-4]。黑豆高蛋白、低热量的营养结构，及其特殊的生理功能活性和药用价值，使得以黑豆为基础物质开发的一系列功能产品具有广阔的市场空间和前景[5-6]。但是豆类及谷物中普遍存在抗营养因子，会降低食物中营养物质的生物利用率，在一定程度上还可能会引起机体的不适。

植酸，又叫肌醇六磷酸酯，由环己六醇与六个磷酸基团结合而成，其水溶性较好，可溶于乙醇（含水）和丙酮，微溶于甲醇和无水乙醇，在植物种子中以其盐类的形式存在，植物里60%～80%的磷存在于植酸中，是磷的主要储存化合物，其中豆类、玉米、小麦和大米等植物籽粒的大部分植酸分别存在于种子、子叶、麸皮和胚芽中，较宽的pH范围内植酸仍具有很强的螯合金属离子的作用[7-10]。相关研究表明，通过植酸对金属离子的捕捉作用，在一定程度上可以起到保护牙齿、预防肾结石以及防治糖尿病的效果，并且植酸摄入量相对较高的人群其患癌率较低[11-12]。但是，由于人体和单胃动物体内缺少植酸酶，植酸进入胃肠道后会与矿物质以及蛋白质形成复合物改变蛋白质结构，并会影响相关酶的活性，从而降低了食物中的金属离子、蛋白质、淀粉等营养物质的生物利用度[13-15]。此外，植酸的热稳定性较强，一般的加工方式难以去除，只有在植酸酶的作用下，植酸被水解成低级肌醇磷酸酯，才能有效消除植酸的抗营养作用[16-17]。

目前，植酸的相关研究多数集中在动物饲料上，如麸皮、豆粕、菜籽粕等，并且均是通过监测动物体重变化、磷利用率等手段来研究植酸的抗营养作用，对于植酸与营养物质的生物有效性关系的研究相对较少。黑豆作为一种深色粗粮，更符合当前的营养理念，但是尚未见到黑豆中植酸的相关研究报道。试验以黑豆为试材，根据植酸盐在较低pH下会发生水解的性质来提取植酸，以盐酸作为浸提液，对提取过程的影响因素进行条件优化，从而得到黑豆中植酸提取的最佳条件，并且能够明确黑豆中植酸的具体含量，可为黑豆中植酸的分布、结构特性、生物活性以及抗营养作用等相关特性研究提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆，龙黑1号，黑龙江大庆市林甸县。

植酸，纯度99%，上海麦克林生化科技有限公司；甘氨酸，德国Biofroxx公司；浓盐酸，天津富宇精细化工有限公司；三氯化铁，天津市永晟精细化工有限公司；磺基水杨酸，辽宁泉瑞试剂有限公司；无水硫酸钠，天津市光复科技发展有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2204B电子天平，上海天美天平仪器有限公司；HZQ-c气浴恒温振荡器，常州金坛良友仪器有限公司；DZG-6020真空干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；TG16-WS高速离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；723N可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司制造；PHS-3C pH计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 植酸的提取方法

根据文献[18-19]进行适当修改。黑豆洗净烘干后，粉碎过0.425 mm筛，称取2.0000 g黑豆粉于锥形瓶中，并加入一定pH的10%硫酸钠-盐酸溶液，在一定条件下振荡，结束后于10000 r/min离心10 min，将上清液移至50 mL容量瓶，定容备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

根据文献[20-21]进行适当修改。分别取40，80，120，160和200 μL 1 mg/mL植酸标准溶液于10 mL容量瓶中，使用甘氨酸-盐酸缓冲溶液（pH 2.4）定容，得到质量浓度为20，40，60，80和100 μg/mL的植酸标准溶液，分别移取5 mL于离心管中，分别添加3 mL显色剂（0.03%三氯化铁-0.3%磺基水杨酸），摇匀静置15 min，按10000 r/min离心10 min，于498 nm测上清液吸光度，绘制出标准曲线。

1.3.3 植酸得率的测定

取0.2 mL提取液于15 mL离心管中，补加pH 2.4的甘氨酸-盐酸缓冲溶液至5 mL，再加入3 mL显色剂（0.03%三氯化铁-0.3%磺基水杨酸），之后步骤同1.3.2小节，并通过植酸标准曲线计算出0.2 mL提取液中植酸得率。

式中：R为植酸得率，mg/g；m为根据标准曲线计算得到的0.2 mL提取液中植酸的质量，mg；M为原料质量，g。

1.3.4 单因素试验设计

1.3.4.1 提取pH对植酸得率的影响

称取2.0000 g黑豆粉，按料液比1∶14（g/mL）加入pH分别为1，2，3，4和5的提取剂，于30 ℃振荡2 h，离心后上清液转移至50 mL容量瓶。

1.3.4.2 提取料液比对植酸得率的影响

称取2.0000 g黑豆粉，分别按料液比1∶8，1∶10，1∶12，1∶14和1∶16（g/mL）加入pH 2的10%硫酸钠-盐酸溶液，于30 ℃振荡2 h，离心得上清液，定容至50 mL容量瓶。

1.3.4.3 提取时间对植酸得率的影响

称取2.0000 g黑豆粉，按料液比1∶14（g/mL），加入pH 2的提取剂，于30 ℃振荡提取，提取时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，离心后上清液转移至50 mL容量瓶。

1.3.4.4 提取温度对植酸得率的影响

称取2.0000 g黑豆粉，按料液比1∶14（g/mL），加入pH 2的提取剂，分别在30，40，50，60和70 ℃下振荡2.0 h，离心后上清液转移至50 mL容量瓶。

1.3.5 正交试验设计

在单因素试验结果的基础上，选择料液比、提取pH、温度、时间为试验因素，每个因素取3个水平，以植酸得率为指标进行正交试验设计（表1）。

表1 正交试验因素水平表

1.3.6 数据处理及统计方法

试验结果均是3次重复试验的平均值，数据采用SPSS 17.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

植酸标准曲线的方程为y=-2.678x+0.527，R2=0.999，其中y为测定的吸光度，x为溶液中的植酸含量，线性范围在0～0.1 mg之间。

2.2 单因素试验

2.2.1 溶液pH对植酸得率的影响

由图1可知，浸提液的pH对植酸得率的影响较大，随着pH的增加，植酸得率呈现一个先上升后下降的趋势，在pH 2时植酸得率达到最大。游离植酸与植酸盐在一定的pH范围内可以相互转换，pH降低时，植酸与金属阳离子之间的络合作用会逐渐减弱，植酸被释放出来，但是在较低pH下，由于一些酸性多糖和蛋白的溶出又会使游离植酸含量降低[22-23]。因此选择pH 2为最佳提取pH。

图1 pH对植酸得率的影响

2.2.2 料液比对植酸得率的影响

由图2可知，在1∶8～1∶16（g/mL）料液比的范围内，植酸得率随着料液比的变化先迅速增加，之后在1∶14（g/mL）时趋于平缓。在液体质量浓度比较低时，由于溶剂较少，黑豆粉不能够被充分浸泡，使得植酸不能很好地溶出，随着液体质量浓度的增大，黑豆粉在溶剂中可以处于一种分散状态，更有利于植酸的溶出，并且植酸的扩散速率也会随之增大，使植酸能够充分进入到溶剂中[24]。因此选择1∶14（g/mL）作为提取的最佳料液比。

图2 料液比对植酸得率的影响

2.2.3 浸提时间对植酸得率的影响

由图3可知，在0.5～1.5 h范围内，植酸得率逐渐增大，在1.5 h时植酸得率达到最大值，此时继续延长浸提时间，植酸得率则出现小幅度的下降趋势。植酸的溶出是一个动态的过程，并且需要一定的时间植酸才能够充分地游离出来，当植酸的溶出达到平衡后，此时如果继续延长浸提时间，游离出的部分植酸会与环境中的其他物质形成复合物，从而使植酸得率呈现出下降趋势[25]。因此选择1.5 h为最佳提取时间。

图3 时间对植酸得率的影响

2.2.4 浸提温度对植酸得率的影响

由图4可知，在30～60 ℃范围内，随着浸提温度的升高，植酸得率也在不断增大，在60 ℃时达到最大值，若继续增加温度，植酸得率出现下降趋势。考虑到植酸的热稳定较强，以及黑豆的内源植酸酶在低pH和高温下已经失活，因此植酸因高温和酶作用而发生分解从而导致得率降低的可能性较低。黑豆蛋白含量较高，而蛋白质在较高温度下长时间水浴会发生变性，从而聚集沉淀，由此推断较高温度下蛋白聚集沉淀导致植酸与蛋白复合物存在于残渣中，从而使提取液中植酸的得率减少[26]。因此选择60 ℃为最佳提取温度。

图4 温度对植酸得率的影响

2.3 正交试验结果

由表2和表3可知，4个因素对植酸得率的影响主次顺序为pH＞料液比＞时间＞温度，料液比、pH、时间对植酸得率的影响为极显著，提取温度影响显著，确定植酸提取的最佳工艺条件A3B2C2D2，即料液比1∶16（g/mL）、pH 2、提取温度60 ℃、提取时间1.5 h，在此条件下进行3次重复试验，植酸得率平均值为10.71 mg/g。

表2 正交试验直观分析

表3 正交试验方差分析

3 结论

以黑豆为原料，选择10%硫酸钠-盐酸作为浸提液，考察了料液比、pH、时间、温度对黑豆中植酸提取的影响，在单因素试验结果的基础上进行正交试验，获得最佳提取工艺：料液比1∶16（g/mL）、pH 2、温度60 ℃、时间1.5 h，在此条件下植酸得率为10.71 mg/g。研究建立了黑豆中植酸的提取方法，并且明确了黑豆中植酸的具体得率，可为黑豆中植酸的分离纯化提供技术支持，并对后续黑豆中植酸的结构、性质以及抗营养作用等相关研究提供一定的研究基础。酸浸法是提取植酸的普遍方法，依据的是植酸与植酸盐在一定的pH范围内能够相互转换，但该方法存在的问题是提取时间长、提取率相对偏低，因此可考虑结合超声、微波等辅助手段进行提取，以提升植酸得率以及缩短提取时间[27]。