鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株GE296_RS01450基因介导其对重金属离子产生耐受性的分析

秦明星，宫晓炜，陈启伟，王燕萍，权 衡，朱雨佳，郑福英*，蔺国珍*

(1.西北民族大学，生命科学与工程学院，兰州 730030；2. 中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046)

鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipesfier，R.anatipesfier)是一种革兰阴性菌，大小为0.2～0.4 μm，无鞭毛，属于黄杆菌科，里默氏菌属[1]。该菌可感染鸭、鹅、鸡、火鸡等家禽和野禽，尤其是2～5周龄的雏鸭易感，且发病鸭的死亡率较高，是危害养鸭业的重大细菌性病原之一。迄今为止，国际上公认的该菌的血清型有21种，各血清型之间无交叉保护作用，给疫苗预防增加了很大难度。因此，利用抗生素进行预防和治疗仍然是控制鸭疫里默氏杆菌感染的重要手段，但抗生素的广泛使用促进了一些耐药菌株的产生和扩散。基于此，科研人员开展了鸭疫里默氏杆菌外排泵介导的耐药机制的研究，以期提高抗生素的应用效果，并控制耐药菌株的产生[2-5]。

RND外排泵在革兰阴性菌中广泛存在，并且发挥多种生物学功能。RND外排泵由内膜蛋白(inner membrane protein，IMP)、外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)和周质膜融合蛋白(membrane fusion protein，MFP)构成三重外排复合体[6-7]。RND外排泵具有广泛的底物谱，包括抗生素、去污剂、有机溶剂、消毒剂、重金属等，在特定条件下RND外排泵还能够外排毒力因子[8]。根据NCBI GenBank数据库中发表的鸭疫里默氏杆菌基因组序列，该菌中存在3个RND外排泵系统，在RA-LZ01株中定位于GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455、GE296_RS05160-GE296_RS05165-GE296_RS05170和GE296_RS05660-GE296_RS05665-GE296_RS05770。GE296_RS05660-GE296_RS05665-GE296_RS05770对应于RA-GD株的RIA_1117-RIA_1118-RIA_1119，该外排泵可外排氨基糖苷类抗生素和去污剂，被命名为RaeE-RaeF-RopN[9]。GE296_RS05160-GE296_RS05165-GE296_RS05170对应于RA-CH-1菌株的B739_0871-B739_0872-B739_0873 和RA-GD菌株的RIA_1214-RIA_1215-RIA_1216，被命名为RaeC-RaeA-RaeB，该外排泵亦外排氨基糖苷类抗生素和去污剂[10]。GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455对应于RA-GD菌株的RIA_1991-RIA_1992-RIA_1993，关于该外排泵的功能目前还未见报道。

GE296_RS01450基因位于RA-LZ01株基因组中的318 644—319 879 bp，读码框大小为1 236 bp，编码411个氨基酸，在已发表的鸭疫里默氏杆菌基因组序列中高度保守，核苷酸序列相似性为95.93%～100%，氨基酸序列相似性为97.56%～100%。该基因编码的产物标注为GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455外排泵的外膜蛋白，预测介导金属离子的外排。多种微量金属元素，比如锰、镍、铜、钴、锌、铁等对于细菌的生命活动至关重要，细菌中的多种酶类均需要不同的金属离子作为辅因子，以维持细菌的正常生长[11]。宿主通过降低金属的有效性以及利用金属元素的毒性是其控制自身被细菌感染的一种重要机制[12]；另一方面，细菌会通过各种途径获得维持自身生存的金属元素，但过量的金属离子会对细菌细胞产生毒性，细菌必须通过多种调控机制维持金属元素在体内外的平衡[13]，其中细菌外排泵可发挥重要作用，比如大肠杆菌中外排铜和银的RND外排泵CusCBA、外排镍和钴的RcnB外排泵等[14-15]。目前关于鸭疫里默氏杆菌中外排金属离子的外排泵还未见相关报道。

鉴于基因组注释中预测GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455外排泵介导金属离子的外排，本研究通过构建GE296_RS01450基因缺失株Δ1450和回复株cΔ1450，测定亲本株RA-LZ01和缺失株Δ1450的生长曲线、对抗菌素和重金属的敏感性，以及GE296_RS01450基因在金属离子刺激下的转录水平等试验，研究GE296_RS01450基因对鸭疫里默氏杆菌生长能力的影响及其外排底物，重点验证该基因是否介导鸭疫里默氏杆菌对重金属离子的外排，以期明确GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455外排泵是否外排重金属离子，以拓展对鸭疫里默氏杆菌RND外排泵功能的理解。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01(GenBank登录号：NZ_CP045564.1)和LJW-2菌株、大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌X7213、自杀质粒pRE112和穿梭质粒pCPRA，均由本实验室保存，来源同文献[5]；Trans-1感受态购自北京全式金公司。

1.1.2 培养基和试剂 胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)购自美国 BD difcoTM公司，LB肉汤购自英国Oxoid 公司，琼脂粉购自北京Solarbio公司，2,6-二氨基庚二酸(DPA)购自东京化成工业株式会社；抗生素购自北京Solarbio公司，重金属试剂购自上海麦克林生化科技有限公司，限制性内切酶SacⅠ、SphⅠ、PstⅠ，T4连接酶，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒均购自TaKaRa 公司，细菌RNA提取试剂盒购自美国ThermoFisher公司，0.22 μm 无菌硝酸纤维素膜和过滤器购自美国 Millipore 公司，SYBR qPCR Master Mix和HiScriptΙΙ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购自南京Vazyme生物科技有限公司。

1.1.3 主要设备 台式高速离心机购自Beckman公司，紫外分光光度计购于美国 Backman公司，PCR热循环仪购自杭州博日科技公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司，摇床购自上海苏坤实业有限公司，凝胶成像仪购自美国Bio-Rad 公司，实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 本研究中所用的引物见表1。

表1 PCR引物名称和序列

1.2.2 构建缺失株Δ1450 以亲本株RA-LZ01株的基因组为模板，以1450-U-F/1450-U-R和1450-D-F/1450-D-R为引物扩增GE296_RS01450基因的上游同源臂和下游同源臂；以菌株LJW-2基因组为模板，以Erm-F/Erm-R 为引物扩增ermF抗性基因；通过重叠PCR将上游同源臂、ermF抗性基因和下游同源臂依次进行融合，构建打靶片段(该片段包括GE296_RS01450基因上游同源臂626 bp，ermF抗性基因801 bp以及下游同源臂626 bp)；用SacⅠ和SphⅠ酶将打靶片段克隆进自杀质粒pRE112，重组质粒转化进大肠杆菌X7213化学感受态细胞中，涂布在含50 mg·L-1DPA、25 mg·L-1氯霉素的LB固体培养板，37 ℃培养18～24 h，挑单菌落接种至含50 mg·L-1DPA、25 mg·L-1氯霉素的LB液体培养基进行增菌，随后分别用引物1450-U-F/1450-D-R进行PCR鉴定，并将扩增到的PCR产物进行测序，得到的阳性菌株即为供体菌，命名为X7213-pRE112-1450。

通过结合转移和同源重组的方法构建GE296_RS01450基因缺失株Δ1450。受体菌RA-LZ01和供体菌X7213-pRE112-1450分别培养至OD600 nm值约为1.0和0.6，分别取2 mL受体菌和4 mL供体菌，4 ℃ 6 000 r·min-1离心5 min，弃上清并收集菌体，用1 mL 0.01 mol·L-1的MgSO4重悬菌体，4 ℃ 6 000 r·min-1离心10 min，重复3次，最后分别用500 μL的0.01 mol·L-1的MgSO4重悬后混匀，用无菌的0.22 μm的硝酸纤维素膜过滤，取下滤膜后，将无菌的一面贴于含50 mg·L-1DPA的TSA平板上，37 ℃，5%CO2培养箱培养24～36 h，取下滤膜，用2 mL 0.01 mol·L-1MgSO4洗下滤膜上的菌苔，取200 μL 涂布在含2 mg·L-1红霉素、5 mg·L-1多黏菌素B的TSA平板，37 ℃ 5% CO2培养箱培养18～24 h， 挑取单克隆并在含2 mg·L-1红霉素、5 mg·L-1多黏菌素B的TSB培养基中进行增菌，分别用鸭疫里默氏杆菌保守引物OmpA-F/OmpA-R、1450-U-F/1450-D-R、Erm-F/Erm-R、1450-800-F/1450-800-R进行PCR鉴定，并将扩增到的PCR产物进行测序，得到的阳性菌株即为缺失株Δ1450。

1.2.3 构建回复株cΔ1450 以亲本株RA-LZ01基因组为模板，1450-F/1450-R为引物，扩增GE296_RS01450基因；用PstⅠ和SphⅠ酶将目的基因克隆进穿梭质粒pCPRA，重组质粒转化进X7213化学感受态细胞中，涂布在含50 mg·L-1DPA、100 mg·L-1氨苄青霉素的LB固体培养板，37 ℃培养18～24 h，挑单菌落进行增菌，随后用引物1450-F/1450-R进行PCR鉴定，并将扩增到的PCR产物进行测序，得到的阳性菌株即为供体菌，命名为X7213-pCPRA-1450。

将缺失株Δ1450和供体菌X7213-pCP29-1450分别培养至OD600 nm值约为1.0和0.6，然后通过结合转移的方法将回复质粒转入缺失株，操作步骤如“1.2.2”。以含1 mg·L-1头孢西丁的TSA平板进行筛选，挑取单菌落进行增菌，分别以OmpA-F/OmpA-R、1450-F/1450-R为引物进行PCR鉴定，并将扩增到的PCR产物进行测序，得到的阳性菌株即为回复株cΔ1450。

1.2.4 菌株CFU和生长曲线测定 将亲本株和缺失株分别增菌至OD600 nm约为1.0，以10倍稀释至10-7、10-8、10-9三个浓度梯度，取100 μL分别涂布在TSA平板，每个样本做3个重复，培养至单菌落长出，计算每个菌株的菌落形成单位(CFU)。

调整每个菌株的起始浓度均为109CFU·mL-1。以1∶100的比例分别接种至10 mL TSB中，每个菌株的接种量均为108CFU。将培养物以37 ℃，200 r·min-1培养，每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度计测量其OD600 nm值，共测定12 h。每个菌株做3组平行试验[16-17]。

1.2.6 菌株对重金属离子的敏感性试验 将经121 ℃ 20 min高压的TSA培养基冷却至40 ℃左右，分别加入AgCl、 ZnSO4、BaSO4、FeSO4、MnCl2、CuSO4、NiCl2、CoCl2、CaCl2、MgSO4共10种重金属试剂，分别配制成含不同浓度金属离子的培养板，各金属离子的浓度如下：AgCl(1.46～0.21 mmol·L-1)；ZnSO4(0.70～0.11 mmol·L-1)；BaSO4(0.86～0.13 mmol·L-1)；FeSO4(1.32～0.16 mmol·L-1)；MnCl2(1.59～0.24 mmol·L-1)；CuSO4(0.80～0.12 mmol·L-1)；NiCl2(1.54～0.23 mmol·L-1)；CoCl2(0.84～0.13 mmol·L-1)； CaCl2(1.80～0.18 mmol·L-1)；MgSO4(1.66～0.17 mmol·L-1)，将新鲜菌液以1∶100比例重新转接后，增菌至OD600 nm约1.0，10倍稀释至10 CFU·mL-1，取106～10 CFU·mL-1的菌液，每个菌液样本取5 μL进行点板，将培养板在含5% CO2，37 ℃恒温培养箱培养18～24 h，观察菌落生长状况。

1.2.7 实时定量RT-PCR 为了确定在不同重金属离子的刺激下，GE296_RS01450基因的转录水平，将亲本株分别在含CoCl2(0.42 mmol·L-1)，NiCl2(1.45 mmol·L-1)和MnCl2(1.59 mmol·L-1)的TSB中培养至OD600 nm约为1.0，用细菌RNA提取试剂盒提取总RNA, 然后用gDNA wiper 反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，作为模板备用。qRT-PCR 反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃ 30 s 预变性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环40次，熔解曲线分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以特异性引物GAPDH-F/GADPH-R、q1450-F/q1450-R分别扩增GAPDH和GE296_RS01450基因，其中GADPH基因作为内参。通过2-△△Ct方法计算相对基因表达量，并进行差异性分析。*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001，NS示差异不显著。

2 结 果

2.1 缺失株Δ1450和回复株cΔ1450的构建

以引物OmpA-F/OmpA-R、Erm-F/Erm-R、1450-U-F/1450-D-R、1450-800-F/1450-800-R对缺失株进行PCR鉴定，前三对引物扩增出目的条带，同时第四对引物扩增不出目的条带即为缺失株(图1A)。将扩增到的PCR产物进一步测序，证实GE296_RS01450基因缺失株Δ1450构建成功。

A. 缺失株Δ1450的鉴定[M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1. OmpA基因扩增(1 156 bp)；2. ErmF基因扩增(801 bp)；3. GE296_RS01450基因上游同源臂、ErmF基因和下游同源臂片段扩增(2 053 bp)；4. GE296_RS01450基因扩增(800 bp)]；B. 回复株cΔ1450的鉴定[M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1.OmpA基因扩增(1 156 bp)；2.GE296_RS01450基因扩增(1 236 bp)]A. Identification of the deletion strain Δ1450 (M. DL2000 DNA marker; 1. OmpA gene (1 156 bp) amplification; 2. ErmF gene (801 bp) amplification; 3. DNA fragment (2 053 bp) including upstream homology arm, ErmF gene and downstream homology arm of GE296_RS01450; 4. GE296_RS01450 gene (800 bp) amplification); B. Identification of the complemented strain cΔ1450 (M. DL2000 DNA marker；1. OmpA gene (1 156 bp) amplification; 2. GE296_RS01450 gene (1 236 bp) amplification)图1 缺失株Δ1450和回复株cΔ1450的鉴定Fig.1 Identification of the deletion mutant Δ1450 and complemented strain cΔ1450

以引物OmpA-F/OmpA-R、1450-F/1450-R对回复株进行PCR鉴定，两对引物同时扩增出目的片段即为回复株(图1B)。将扩增到的PCR产物进一步测序，证实基因回复株cΔ1450构建成功。

2.2 菌株CFU和生长曲线

为证明GE296_RS01450基因的缺失是否影响菌株的生长速率，测定了亲本株RA-LZ01和缺失株Δ1450的CFU和生长速率。经过测定亲本株 RA-LZ01为9.76×1010CFU·mL-1；缺失株Δ1450为1.963×1010CFU·mL-1。与亲本株RA-LZ01相比，缺失株Δ1450的生长速率并未发生明显变化(图2)。

图2 亲本株RA-LZ01和缺失株Δ1450的生长曲线Fig.2 Growth curves of wild strain RA-LZ01 and deletion strain Δ1450

2.3 药敏试验

通过测定亲本株RA-LZ01和缺失株Δ1450对11类共27种抗菌素的MIC值，结果表明与亲本株RA-LZ01相比，抗菌素对Δ1450的MIC值并未发生明显变化，说明GE296_RS01450基因不介导菌株对抗菌素的耐药。

2.4 菌株对重金属的敏感性

重金属离子点板试验结果显示，与亲本株RA-LZ01相比，缺失株Δ1450对CuSO4、ZnSO4、AgCl、BaSO4、FeSO4、CaCl2、MgSO4的耐受性均没有发生改变，但对MnCl2、NiCl2和CoCl2的敏感性显著升高；回复株cΔ1450部分回复了对MnCl2、NiCl2和CoCl2的耐受。该结果说明GE296_RS01450基因介导菌株RA-LZ01对重金属Mn、Ni和Co的耐受(图3)。

图3 菌株对重金属离子的敏感性Fig.3 Sensitivity of the strains to heavy metal ions

2.5 实时定量RT-PCR

通过实时荧光定量RT-PCR结果分析，发现在NiCl2和MnCl2的作用下，亲本株RA-LZ01中GE296_RS01450基因的相对转录水平分别提高了37倍和20倍，但在CoCl2的作用下，GE296_RS01450基因的相对转录水平无显著变化(图4A)；然而，在NiCl2、MnCl2和CoCl2作用下，回复株cΔ1450中GE296_RS01450基因的相对转录水平均无明显变化(图4B)。

3 讨 论

迄今为止，由鸭疫里默氏杆菌引起的鸭浆膜炎是造成养禽业重大经济损失，制约养禽业发展的重要传染病。该病的发生具有明显的季节性，一般在春夏、秋冬交替的时节多发，临床上主要表现为精神沉郁、眼和鼻分泌物增多、下痢、共济失调和生长率下降。其死亡率高达80%[20-21]。在生产生活中一般通过抗菌素对该病进行预防和治疗，但由于长时间使用抗菌素，导致鸭疫里默氏杆菌在抗菌素的压力下，产生的耐药菌株逐渐增多，并产生多重耐药性(MDR)，使得现有的抗菌素对于菌株的影响逐渐减小，因此，对细菌的外排耐药机制进行研究更加有利于对细菌进行防控。

在构成生命体必需元素中，微量金属元素虽然只占人体质量的 0.05%，但在生命活动过程中具有极其重要的作用。它们是多种金属蛋白/金属酶的活性中心。金属蛋白和金属酶的作用涉及到了内稳态调节、电子传递、生物能的产生、基本生物分子的合成、生物物质的传输、氧化应激、信号转导、基因调控、物质/能量代谢调控和药物代谢等各个方面[22]。细胞内金属离子的传递、代谢、稳态平衡的失调，是导致多种疾病的关键因素[23]。锰(Mn)、镍(Ni)和钴(Co)离子都是细胞生长过程中必不可少的微量重金属离子，但其过量的存在对于细胞又具有毒性作用，因此维持细菌细胞内重金属离子的稳态是重金属外排泵的存在意义[24]。除了通过抗生素对鸭疫里默氏杆菌进行防控外，还可以通过重金属进行防控。

RND外排泵具有广泛的底物谱，最常见的底物为抗生素。目前为止，关于鸭疫里默氏杆菌外排泵的研究已有报道，如鸭疫里默氏杆菌CH-1菌株的RND外排泵基因B739_0873参与该菌对氨基糖苷类抗生素及去污剂的耐药性，该基因的缺失导致其耐药性降低[21]；鸭疫里默氏杆菌RA-GD菌株的ABC外排泵基因RIA-1614基因编码的RanB蛋白介导其对氨基糖苷类抗生素和有机溶剂的耐受性，该基因的缺失导致其对阿米卡星、链霉素和几种有机溶剂的敏感性上升[25]；鸭疫里默氏杆菌CH3菌株的M949_0459基因决定着该菌对替加环素的耐药性，该基因的缺失导致其对替加环素的耐药性降低[26]；鸭疫里默氏杆菌RA-GD菌株的RND外排泵RaeE-RaeF-RopN介菌株RA-GD对阿米卡星、链霉素和SDS的耐药性并且与其生长速率有关，该系统的缺失导致其耐药性和生长速率降低[9]。基于上述研究结果，本研究首先验证作为RND外排泵外膜蛋白组分的GE296_RS01450是否介导抗生素的外排。通过测定11类共27种抗菌素的MIC值，结果表明，GE296_RS01450灭活后，各种抗菌素对菌株的MIC值并无差异，说明该基因与抗菌素的外排无关。

A.RAΔLZ01; B.cΔ1450图4 亲本株RAΔLZ01和回复株cΔ1450在重金属离子作用下GE296_RS01450基因的相对转录水平Fig.4 The relative transcriptional levels of GE296_RS01450 gene of parental strain RA-LZ01 and complemented strain cΔ1450 treated with heavy metal ions

尽管许多RND系统研究结果表明该系统与抗菌素的耐药性有关，但目前的研究结果也表明该系统还涉及许多的表型，包括新陈代谢，生物膜生成，铁的获取和毒力等。本研究通过测定亲本株和缺失株的生长曲线与CFU值发现，GE296_RS01450基因并不介导RA-LZ01菌株对抗菌素的耐受性，也与其生长能力无关。

目前对于重金属离子RND外排泵的研究较少，主要有大肠杆菌中能够有效排出细胞周质和细胞质中的铜(Cu)和银(Ag)离子的CusCBA外排泵和能同时外排镍(Ni)和钴(Co)离子的RcnB外排泵[15]；耐重金属根瘤菌中能够有效结合锌并排出锌(Zn)离子的ZneA外排泵[27]；铜绿假单胞菌中能够排出细胞周质与细胞质内的锌(Zn)、镉(Cd)和钴(Co)离子的CzcCBA外排系统等[12]。但目前有关鸭疫里默氏杆菌外排重金属离子的外排泵还未见报道。本研究发现，鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01菌株中的GE296_RS01450基因的缺失导致其对于重金属离子Ni、Mn和Co的耐受性显著下降，说明该基因在RA-LZ01菌株外排重金属离子Ni、Mn和Co的过程中发挥作用。

RND外排泵的底物通常情况下可以诱导基因的转录水平上调，如链霉素和SDS使RaeE-RaeF-RopN外排泵的转录水平上调[22]，因此本研究应用qPCR验证了MnCl2、NiCl2和CoCl2是否为GE296_RS01450基因的诱导底物。结果显示，在MnCl2和NiCl2作用下，亲本株中GE296_RS01450基因的转录水平显著上调，但CoCl2并没有刺激该基因的转录水平发生明显变化，可能RA-LZ01菌株中还存在其他调控CoCl2平衡的机制。然而，在NiCl2、MnCl2和CoCl2作用下，回复株cΔ1450中GE296_RS01450基因的相对转录水平均无明显变化，出现该结果可能与RND外排泵相关基因的转录和表达受到多种调控因子的调控有关，比如激活因子、抑制因子、双组分系统等；外排泵的底物可与相关调控蛋白结合，从而诱导外排泵相关基因的表达[28]。亲本株中GE296_RS01450基因是天然状态，在底物存在的情况下可被其调控因子进行调控，而回复株中GE296_RS01450基因位于回复质粒pCRRA中，脱离了整体调控环境，不能被底物诱导发生高水平转录。对于GE296_RS01450基因所受到的调控机制还需要深入研究。

4 结 论

成功构建GE296_RS01450基因缺失株Δ1450和回复株cΔ1450，证实该基因不参与菌株生长及菌株对抗生素(本研究中测定的抗菌素)的外排，可介导菌株对重金属离子Ni、Mn和Co的外排。鉴于前期研究中已将鸭疫里默氏杆菌的其他两个RND外排泵命名为RaeC-RaeA-RaeB和RaeE-RaeF-RopN，我们将GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455外排泵命名为RaeX-RaeY-RopM，其中GE296_RS01445、GE296_RS01450和GE296_RS01455分别对应于外排泵RaeY、外膜蛋白RopM和周质蛋白RaeX。