基于Mono Trap方法对酱油气味活性成分的分析

王逍君， 孟 琦， 宋焕禄

(北京工商大学 食品与健康学院， 北京 100048)

酱油是我国传统发酵调味品，是以大豆或脱脂大豆辅以小麦、麸皮等为原料，经多种微生物协同发酵，制得的具有特殊风味与颜色的液体调味品[1-3]。气味特征是影响酱油品质高低的重要因素之一。目前，国内外对酱油香气成分的富集方法主要有顶空固相微萃取(HS- SPME)法[4-6]、溶剂辅助风味蒸发(SAFE)法[7-10]、液液萃取(LLE)法[11]、同时蒸馏萃取(SDE)法[12]、搅拌棒吸附萃取(SBSE)法[13]、动态顶空制样(DHS)[12]等，其中固相微萃取(SPME)法和液液萃取法使用最为广泛。SPME简单无需使用有机试剂，但对于高沸点低挥发性气味化合物的萃取效果不佳；SDE在煮沸样品的过程中会导致样品中原有气味活性物质的分解或生成新的气味化合物[14]，其分析结果无法保证酱油中原有气味成分的真实性；SBSE受涂层材料的限制，对气味活性化合物的吸附效果有限。

固相萃取整体捕集剂(monolithic material sorptive extraction，Mono Trap)是一种新型萃取材料，集硅胶、活性炭、十八烷基硅烷特性为一体的高交联性吸附剂。Mono Trap硅胶骨架里混合了活性炭，对极性物质、低沸点物质、芳烃具有较好的吸附作用，可吸附分散在任何基质中的高挥发性、低挥发性、极性、非极性、液态及气态物质[15]。Lu等[16]应用Mono Trap对常见亚洲鲤鱼肉的特征气味物质进行了研究，结果显示化合物的萃取效果良好；Fu等[17]利用Mono Trap结合GC- MS和电子鼻建立热氧化体系，研究中华绒螯蟹中关键脂类物质；Jang等[18]对Mono Trap结合GC- MS测定马缨丹香气化合物的萃取条件进行了优化。但是，将Mono Trap新型萃取材料应用于酱油气味活性成分的研究还较少。

本研究以高盐稀态酿造酱油为研究对象，使用Mono Trap结合热脱附以及GC- O- MS对气味活性化合物进行萃取与分析，通过优化萃取条件建立分析方法；同时使用SPME萃取相同酱油样品并进行GC- O- MS分析，将Mono Trap与SPME的分析结果进行对比。研究结果将为进一步深入探究酱油的风味成分提供一定的理论支持与帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高盐稀态酿造酱油，千禾味业食品股份有限公司；C6～C30的正构系列烷烃，色谱纯，美国Sigma公司；Mono Trap(RGPS- TD、RSC18- TD、RGC18- TD)，日本岛津- GL Sciences公司。

1.2 仪器与设备

7890A- 7000B型GC- MS联用仪、DB- Wax色谱柱，美国Agilent公司；Sniffer 9000型嗅闻仪，瑞士Brechbuhler公司；多功能自动进样器(multipupose sampler，MPS)、热脱附系统(thermal desorption system，TDS)、PTV冷却型进样口(cooled injection system，CIS)、玻璃衬管，德国Gerstel公司；MYP19- 2型恒温磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1萃取条件的正交试验设计

Mono Trap方法是一种较为新型的样品前处理方法。为确定最佳的萃取条件，参照赵谋明等[5]以及顾赛麒等[19]的方法并稍作修改，设计L9(34)正交试验(见表1)，确定Mono Trap方法的最优萃取条件。Mono Trap使用前在250 ℃ TDS中老化1 h，载气流量1.2 mL/min。

表1 正交试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.2萃取方法

1.3.2.1 固相微萃取方法

参照赵谋明等[5]对酱油的萃取方法并稍作修改。样品使用前放于原商品包装瓶中不开封，于4 ℃冰箱保存。实验时，准确量取10 mL酱油于40 mL顶空瓶中，加入1 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL)作为内标物。45 ℃下保温平衡20 min，用75 μm CAR/PDMS萃取头在45 ℃下萃取40 min，萃取结束后在GC进样口230 ℃下解析5 min。2个样品间萃取头250 ℃老化10 min，以防止样品间相互污染。

1.3.2.2 固相萃取整体捕集剂萃取方法

将1个Mono Trap RGPS- TD(MTRGPS- TD)放入样品瓶中，使其完全浸入到酱油液体中，置于恒温磁力搅拌器上进行吸附萃取，待萃取完毕后，将MTRGPS- TD取出，用超纯水冲洗后再用滤纸吸干水分，最后将MTRGPS- TD置于热脱附装置中解吸附，进行GC- O- MS分析。

1.3.3GC-O-MS分析条件

GC条件：色谱柱DB- Wax(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；载气为99.999%氦气，流量1 mL/min；升温程序为初始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升温到200 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；进样方式为不分流。

MS条件：电子轰击(EI)离子源，电离能量70 eV；离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，检测器温度250 ℃；扫描模式为全扫模式，质量扫描范围m/z40～500。

TDS条件：不分流模式；热解吸程序为起始温度40 ℃，60 ℃/min升到260 ℃，保持5 min。

CIS条件：液氮制冷，起始温度-50 ℃，平衡1 min，12 ℃/s升至250 ℃，保持1 min。

嗅闻仪条件：Sniffer 9000型嗅闻仪传输线温度250 ℃，嗅闻口用氮气探入超纯水瓶补充水蒸气，嗅闻口温度200 ℃。每个小组成员在嗅闻前都经过培训，以便熟悉各种气味描述。5名小组成员快速准确记录从嗅闻口中感受到的流出物的气味特征和时间。

1.3.4挥发性化合物定性与定量分析

挥发性化合物的定性通过与NIST11谱库进行比较。同时根据相同色谱条件下标准品保留时间和相同色谱条件下C6～C30正构烷烃的保留时间计算检测物质的保留指数(RI)，并与文献报道的RI进行比对。定量分析方法以对酱油中挥发性化合物进行分离鉴定时添加的质量浓度0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮为内标物，通过内标物的峰面积与气味活性化合物的峰面积比值计算各物质的含量。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010计算各气味化合物的相对含量，使用Origin软件对各化合物的含量绘制热图并进行分析。

2 结果与分析

2.1 Mono Trap方法萃取参数的正交优化结果

在食品风味化学分析中，将样品的仪器分析结果与感官评价相结合能够更为准确地反映出实验方法对样品风味特征的还原度。因此，在优化Mono Trap方法萃取参数时，使用GC- O- MS来验证萃取化合物的气味活性，以保证方法优化结果的有效性。在此基础上检测到的气味活性化合物的峰面积能够代表萃取方法对化合物的萃取量。在保证GC- O- MS嗅闻得到的样品气味属性符合样品实际气味特征的前提下，检测得到的气味活性化合物的数量与峰面积可以反映出萃取条件的优劣。因此，本研究以嗅闻到的气味活性物质总数和这些物质的峰面积为优化指标。

萃取条件优化的正交试验结果及分析见表2、表3。捕集剂种类、萃取时间、萃取温度都对气味化合物的吸附萃取结果有影响，因素水平组合为A3B3C2时，Mono Trap方法具有较佳的萃取效果。

表2 Mono Trap方法正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal experiment for Mono Trap method

表3 正交试验方差分析Tab.3 Analysis of variance of orthogonal experiment

同时，极差分析和方差分析结果表明，3个因素对Mono Trap 吸附萃取酱油气味化合物的影响由大到小依次为捕集剂种类、萃取温度、萃取时间。根据嗅闻到的气味物质总数，最终选定固相萃取整体捕集剂RGC18- TD、萃取时间60 min、萃取温度50 ℃为本研究中Mono Trap方法后续使用的优化萃取方法。

2.2 验证实验结果

使用优化后的Mono Trap方法对酱油重复萃取3次，计算嗅闻到的气味化合物总峰面积，并对3次重复实验之间的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)进行计算，验证方法的可重复性。酱油中含量较高、带有显著花香、蜂蜜味的苯乙醇是酱油典型气味特征的代表化合物。因此，本研究以苯乙醇为例，计算实验方法的加标回收率。向2个酱油样品中分别加入2种不同质量浓度的苯乙醇标准溶液10 μL(1 000、5 000 μg/mL)，采用GC- MS对其进行分析，计算加标回收率[见式(1)]，对优化得出的Mono Trap方法的有效性进行验证。

(1)

加标回收率结果如表4。高添加量下，该方法对苯乙醇的回收率为112.52%；低添加量下，该方法对苯乙醇的回收率为109.12%，均在80%～120%，说明该方法的可重复性和准确度良好，适用于酱油的气味化合物分析。

表4 酱油中苯乙醇的加标回收率Tab.4 Recoveries of phenylethyl alcohol in soy sauce

2.3 Mono Trap和SPME方法对酱油中气味活性物质的鉴定比较

分别通过Mono Trap和SPME方法将酱油样品中的挥发性成分提取出来，进行GC- O- MS分析。2种方法从酱油样品中共鉴定出61种气味活性成分，见表5。其中醇类11种、醛类7种、酮类5种、呋喃及呋喃酮类6种、含硫化合物4种、酯类11种、酚类3种、吡嗪类11种、有机酸类2种、其他化合物1种。不同萃取方式下香气活性化合物含量热图见图1。其中使用SPME方法共嗅闻到55种气味活性化合物,质量浓度共计3.05 mg/L;使用Mono Trap方法共嗅闻到56种化合物，质量浓度共计12.63 mg/L。酱油的气味活性物质多为极性化合物，例如醇、酸、呋喃酮和酚类化合物等。Mono Trap方法的捕集剂中包含有ODS C18成分，其对极性化合物的吸附能力较强，这也可能是这种方法能够检测出更多气味活性物质的原因之一。

酱油中含有丰富的醇类化合物。其中乙醇的含量最高，是发酵过程中由酵母代谢产生的代表性气味活性物质。除此之外，具有花香气味的苯乙醇，被认为是酱油的关键气味活性物质。由表5和图1可知，Mono Trap方法共检测到的这两种醇类化合物的含量分别是SPME方法检测到的1.6倍和4.6倍。从检测到的醇类化合物整体来看，Mono Trap方法共检测到醇类气味活性化合物9种，总质量浓度为4.42 mg/L；SPME共检测到11种，总质量浓度为2.18 mg/L。因此，就醇类化合物而言，Mono Trap方法捕捉或富集化合物的能力更强。

表5 Mono Trap与SPME方法对酱油样品中气味活性成分鉴定结果Tab.5 Identification results of odor-active components in soy sauce samples by Mono Trap and SPME

续表5

*1～61的数字编号分别对应表5中相应序号的化合物。SPME1～SPME3、Mono Trap1～Mono Trap3为3次平行实验。图1 不同萃取方式下酱油香气活性化合物的含量热图Fig.1 Heat map of odor-active compounds in soy sauce

酯类化合物具有典型的水果特征。酱油中含有多种酯类化合物，以乙酸乙酯为主，其次为乳酸乙酯等。这些化合物主要由发酵过程中生成的有机酸和醇类物质通过酯化反应生成，是酱油风味中的代表物质。表5中，Mono Trap和SPME方法检测到酯类气味活性化合物的种类和数量基本相同，Mono Trap方法萃取到的总物质含量稍低于SPME。Mono Trap和SPME方法对酯类气味活性化合物种类方面的萃取能力相差不大，但SPME富集到的化合物含量更高，这可能是由于酯类化合物挥发性较高，因此在样品的顶部空间比样品内部能萃取到更多的化合物。

醛、酮类气味活性化合物一般具有麦芽味、青草味、甜味等[20]，如2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛等。Mono Trap方法中共检测到醛、酮类气味活性物质12种，总质量浓度6.24 mg/L；SPME共检测到醛、酮类气味活性物质10种，总质量浓度0.25 mg/L。就醛、酮类化合物而言，Mono Trap方法能富集到的物质含量更高。

酱油中有机酸类物质主要为乙酸，其次还有丙酸、丁酸等。酸类物质具有酸香，可中和酱油的咸味，还可与酵母代谢产生的醇类反应生成酯类化合物。Mono Trap方法共检测到酸类气味活性物质2种，总质量浓度1.15 mg/L；SPME方法共检测到酸类气味活性物质1种，总质量浓度0.11 mg/L。就酸类化合物而言，Mono Trap方法检测到的化合物含量均高于SPME方法。

酚和吡嗪类化合物在酱油中含量较低，但却是酱油中非常重要的气味化合物，能贡献烤香、烟熏味。Mono Trap方法共检测到酚、吡嗪类气味活性物质13种，共370.61 μg/L；SPME方法共检测到酚、吡嗪类气味活性物质14种，共80.47 μg/L。就酚、吡嗪类化合物而言，Mono Trap方法萃取到的气味化合物的含量高于SPME方法。

呋喃和呋喃酮类物质对酱油气味特征的形成至关重要，尤其是2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮和5-甲基-2-乙基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮，这2种化合物具有焦糖香，在水溶液中呈现出典型的酱油类气味特征，但由于其相对分子质量较大，挥发性相对较低，很难通过SPME方法检测出结果。由表5可知，这2种化合物仅在Mono Trap方法中检测到。就总体而言，Mono Trap方法共检测到这类气味活性物质6种，总质量浓度204.25 μg/L；SPME方法共检测到呋喃类气味活性物质4种，总质量浓度34.24 μg/L。因此， Mono Trap方法在呋喃酮类化合物的萃取及物质含量的富集上较SPME更具优势，可以更好地吸附萃取具有典型酱油气味特征的化合物。

3 结 论

本研究将Mono Trap技术、热脱附和GC- O- MS分析相结合，鉴定了酱油中的气味活性物质；以Mono Trap捕集剂类型、萃取时间和萃取温度为参数通过正交试验，优化确定了适用于酱油气味活性成分分析的Mono Trap方法的萃取条件，即捕集剂RGC18- TD、萃取时间60 min、萃取温度50 ℃。实验结果表明：与经典分析方法SPME相比，使用Mono Trap-GC- O- MS分析方法可以检测出更多具有酱油气味特征的化合物。定量分析显示：Mono Trap方法在提取气味活性物质方面具有萃取量大和回收率高的特点，特别是醇、醛、酸、酮、吡嗪、酚类等化合物的萃取浓度都比SPME方法高。在酯类化合物方面，SPME和Mono Trap方法的萃取能力几乎相同。因此，在酱油的香气成分萃取上，Mono Trap方法比SPME更有优势。这可以归因于酱油的大部分香气活性化合物均为极性化合物，而Mono Trap对极性化合物的吸附能力更强，有效吸附面积更大，特别是可以吸附到更多的挥发性相对较弱的关键气味活性化合物，例如呋喃酮类化合物。这一方法有望成为今后酱油气味活性成分分析的有效研究方法之一。