电刺激对背根神经节和雪旺细胞髓鞘化的影响

2021-11-04雷涛刘玉红张煜梁卓文

中国医学物理学杂志 2021年10期

雷涛，刘玉红，张煜，梁卓文

1.空军军医大学生物医学工程系，陕西西安710032；2.空军军医大学口腔医院口腔科，陕西西安710032；3.联勤保障部队解放军第901医院，安徽合肥230031；4.空军军医大学西京医院，陕西西安710032

前言

促周围神经系统的髓鞘化在周围神经损伤的修复中扮演着重要作用，而周围神经系统的髓鞘化过程是由多因素调节的髓鞘形成细胞-雪旺细胞（SCs）与轴突之间复杂的相互作用过程［1-3］。在腕管综合征引起的正中神经损伤患者术后给予电刺激治疗，证实短暂低频的电刺激治疗可显著促进神经再生，刺激神经支配区域的感觉和运动功能，但具体机制不清楚［4-5］。因此，建立体外的背根神经节（DRG）-SCs-电刺激模型可为研究电刺激促周围神经成髓鞘机制提供基础。

本文设计了一种电刺激细胞培养系统，该系统具备组装简单、高透明性、可滑动拆卸玻片的特点，可用于各种成像设备的观察，无须转移和破坏细胞。该系统可用于DRG-SCs-电刺激模型。

1 材料和方法

1.1 电刺激细胞培养系统的设计

电刺激细胞培养系统包括函数发生器（安捷伦科技公司）和电刺激小室（自制）（图1a）。函数发生器产生波幅为6 Vp-p、频率为10 Hz 矩形波（图1b）。电刺激小室从上到下共由5 个部分组成：聚苯乙烯盖（Biologix, 中国）、中空聚苯乙烯室（Biologix, 中国）、生物相容性垫片（Biologix, 中国）、导电玻璃（58 mm×25 mm×1 mm, 顾洛公司,中国）和聚苯乙烯夹具（Biologix，中国）（图1a）。中空的聚苯乙烯室被生物相容性垫圈包围，导电玻璃在中空聚苯乙烯室的下方。聚苯乙烯夹具固定中空聚苯乙烯室和导电玻璃，防止培养基外流。电刺激小室可根据实验设计进行串联或并联电路。在本研究中，将3个电刺激小室用铜线和导电夹并联，用于多个样本的电刺激干预（图2）。

图1 电刺激细胞培养系统Fig.1 Electrical stimulation(ES)cell culture system

图2 电刺激小室Fig.2 ES chamber

1.2 细胞培养

1.2.1 DRG培养从新生1天SD大鼠收集DRG，剪碎后加入0.5 mL胶原酶、1 mL 0.25%胰蛋白酶（不含乙二胺四乙酸）及1 mL DME/F12（HyClone,USA）消化1 h，用40 μm微孔过滤器过滤后终止消化。以500 g/min的转速离心5 min。将细胞悬浮在含有10%胎牛血清（FBS）的DME/F12培养基（Gibco,USA）中，然后将细胞悬液以3×105个细胞的密度接种在电刺激小室的导电玻璃上。培养24 h 后，更换培养基，用Neurobasal（Gibco,USA）+B27（Gibco, USA）+NGF（50 ng/mL）（R&D Systems,USA）+5-FU（31 μmol/mL）（HSRVEY,USA）培养48 h，去除非DRG细胞，在不含5-FU的培养基中继续培养3 d，以备实验使用［6］。

1.2.2 SCs培养从新生1 天的SD 大鼠收集双侧坐骨神经，剪碎后置入5 mL 离心管中，随后加入1 mL 胶原酶、1 mL 0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）和1 mL DME/F12 进行消化。消化30 min，以500 g/min 的转速离心5 min。将细胞悬浮在含10% FBS 血清的DME/F12 培养基中，37 ℃培养24 h，然后用含5-FU（31 μmol/mL）、Forskolin（10 μmol/mL）和10%FBS血清的DME/F12 培养液纯化48 h，再改为含Forskolin（10 μmol/mL）和10% FBS 血清的DME/F12 培养液培养48 h，以备实验用［6］。

1.2.3 DRG/SCs 共培养将SCs 用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA），消化5 min，500 g/min 的转速离心5 min后使用含10% FBS 血清的DME/F12 培养液重悬，吸除导电玻璃培养板的培养液，将SCs 以2×105的密度接种于培养DRG 的电刺激小室中培养24 h。之后更换为Neurobasal+B27+NGF（50 ng/mL）+5%FBS培养液培养。

1.3 电刺激方案

电刺激小室在使用前经超声波清洗、洗涤、干燥，然后进行紫外线照射消毒（12 h）。消毒后，用多聚赖氨酸包被导电玻璃表面3 h。DRG/SCs 共培养24 h 后分为对照（Ctrl）组和电刺激（ES）组。ES 组给予矩形波电刺激，波幅6 Vp-p，频率10 Hz，1 h/d，7 d。Ctrl组无电刺激。Ctrl组和ES组的培养基每2 d更换1 次。在整个过程中，电极与培养基和细胞不接触，导电玻璃的导电性能正常。

1.4 细胞毒性检测

检测导电玻璃培养系统是否对细胞产生毒性，DRG/SCs 共培养7 d 时，ES 组和Ctrl组细胞样品分别转移至96孔板，在37 ℃，5%CO2培养箱培养24 h，再向每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8（CCK8）溶液，继续培育1 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.5 免疫荧光检测

DRG/SCs 细胞的髓鞘形成由髓磷脂碱性蛋白（MBP）的免疫荧光标示，神经元网络以神经微丝蛋白200（NF200）标示。在第7 天，将DRG/SCs 细胞在室温下用4%多聚甲醛固定30 min。抗MBP 一抗（BIOSS, 中国）和抗NF200 一抗（Abcam, 英国）在4 ℃孵育过夜，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次。避光加入羊抗鼠IgG-488(1：600)二抗、羊抗兔IgG-Cy3（1：600）二抗。用PBS 洗涤3 次后，在莱卡倒置荧光显微镜成像系统下观察细胞。随机选择5 个视野。用ImageJ 软件分析荧光强度和面积。荧光密度由荧光强度除以面积得到。

1.6 统计学分析

结果以均值±标准误表示，P<0.05认为结果有统计学差异。数据用SPSS 20.0.0统计软件进行分析。每个实验至少重复3次。组间比较采用独立样本t检验分析。

2 结果

CCK8 细胞毒性结果显示（图3），ES 组的光密度（OD）值略高于Ctrl 组，但两组之间无统计学意义（P>0.05）。因此，证实导电玻璃培养体系对神经细胞无毒性。

图3 7天的电刺激对DRG/SCs细胞毒性的影响Fig.3 Effects of 7-day ES on the cytotoxicity of DRG/SCs

半定量结果显示ES组MBP荧光强度明显高于Ctrl组（P<0.01）（图4）。图5为Ctrl组和ES组DRG/SCs细胞的MBP蛋白免疫荧光。神经元网络以NF200染色表示（绿色），髓鞘段以MBP染色表示（红色）。

图4 Ctrl组和ES组MBP荧光强度的半定量结果Fig.4 Semi-quantitative results of fluorescence intensity of MBP in control group and ES group

图5 Ctrl组和ES组DRG/SCs细胞的MBP免疫荧光Fig.5 Immunofluorescence of MBP in DRG/SCs in control groups and ES groups

3 讨论

实验结果表明，本文设计的电刺激细胞培养系统对神经细胞安全无毒，连续7 d 的电刺激可提高神经髓鞘化率。

周围神经损伤的自愈能力有限，导致肌肉组织相应萎缩，功能丧失［7-8］。电刺激可以直接促进轴突生长，提高神经修复的速度和成功率［9-10］。同时，电刺激可以增加SCs的活性和神经营养因子的分泌，但具体的分子机制尚不清楚［11-14］。建立一个简单、有效、可重复的电刺激细胞培养系统，对于研究神经细胞与电流的相互作用机制，制定有效的临床电刺激治疗参数尤为重要。与以往报道的电刺激设备相比［15-17］，本研究中的电刺激培养系统组装简单，电极不与培养液和细胞接触，不会产生毒性。另外，该系统电流均匀，高清晰度的导电玻璃可以满足各种检测成像要求。此外，通过使用串联或并联的电刺激室，可以满足不同种类的实验需求。