大鼠心肺复苏后心肌蛋白组学研究与分析

曾朝涛 王鹏飞 杨正飞

据美国心脏协会“心脏病和中风统计2020 年更新”报告，美国每年有超过34.7 万成人发生院外心脏骤停。住院心脏骤停发生率为9.7‰［1］。心脏骤停后即使得到及时的心肺复苏（CPR），心肌缺血、缺氧和能量代谢紊乱也会导致多种损伤，心肺复苏成功的患者由于严重的再灌注损伤，会进一步损害心肌功能，成为心肺复苏后死亡的主要原因［2］。因此，预防和治疗心肺复苏后心肌损伤和功能障碍是改善心肺复苏后患者生存和生活质量的关键。本文尝试通过分析心肺复苏后大鼠心肌差异蛋白，从蛋白质组学角度，为进一步研究心肺复苏后心肌功能障碍机制提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料和器材 所有雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6-8 个月，450-550 克）来自中山大学实验动物中心，并通过中山大学实验动物伦理委员会批准。SAR830/AP 呼吸机（CWE 公司，美国）。超声破碎仪（JY96-IIN，宁波新芝），MPFastprep-24匀浆仪，Q Exactive 质谱仪（Thermo Scientific），Easy nLC 色谱系统（Thermo Scientific）。BCA 定量试剂盒（碧云天），SDT 裂解液（4% SDS，100 mM Tris-HC）。

1.2 大鼠的基线生理学检测 实验前记录各组SD 大鼠心率、平均动脉压（MAP）、肛温。测量动脉血气并记录PH 值、PaO2和乳酸。

1.3 大鼠分组、建模及取样 16 只大鼠随机分为Sham 组和CPR 组，CPR 组使用窒息法建立大鼠心脏骤停模型。采用戊巴比妥麻醉（45 mg/kg，腹腔注射），气管插管连接呼吸机，CPR 组静脉注射维库溴铵（2 mg/kg）进行神经肌肉阻断并夹闭气管导管，当心电图示室颤、全心停搏或无脉活动，MAP<20 mmHg 时则视为心脏骤停。窒息10 分钟后打开夹闭的气管导管，给予纯氧吸入及60 次/分的机械通气，快速静脉注射肾上腺素0.02 mg/kg，每3 分钟一次，同时给予200 次/分的胸外按压。自主循环恢复标准：心电图提示自主心律，MAP≥60 mmHg 并持续5 分钟以上。Sham 组仅麻醉和气管插管。在复苏后不同时间点（0-5 小时）测量大鼠左室射血分数，CPR 后6 小时分离出的血浆和心脏组织立即冷冻并储存在-80℃，用于蛋白检测与分析。

1.4 Label-free 定量蛋白质谱分析 解冻心肌组织加入适量SDT 裂解液，转移至预先装有适量石英砂的2 ml 离心管中，应用MP 匀浆仪进行匀浆破碎。然后超声，沸水浴15 min，14000 g 离心15 min，取上清采用0.22 μm 滤膜过滤，收集滤液。采用BCA 法进行蛋白质定量。采用EasynLC 系统进行分离。样品由自动进样器上样到分析柱分离，流速为300 nL/min。样品经色谱分离后用Q-Exac-tive 质谱仪进行质谱分析。

1.6 差异蛋白分析 使用OE 云工具（网址https：//cloud.oebiotech.cn）对CPR 组和Sham 组差异蛋白进行生物过程（Biological Process，BP），分子功能（Molecular Function，MF）和细胞组分（Cel-lular Component，CC）的基因本体论（Gene Ontolo-gy，GO）富集分析。Reactome 在线网站（网址https：//reactome.org）进行蛋白富集的主要通路分析。

2 结 果

2.1 基线资料及心功能 见表1、图1。

表1 两组大鼠基线资料（±s）

表1 两组大鼠基线资料（±s）

P体重（g）心率（次/分）MAP（mmHg）肛温（℃）PH PaO2(mmHg)乳酸（mmol/L）CA-CPR 组（n=8)505±20 347±18 136±18 36.9±0.4 7.44±0.15 93±12 0.7±0.5 Sham 组（n=8）495±25 356±22 140±26 36.7±0.5 7.50±0.12 96±17 0.8±0.4 NS NS NS NS NS NS NS

图1 CPR 后各组大鼠心功能情况

2.2 差异蛋白分析 从CPR 组及Sham 组中鉴定出1049 种蛋白，其中1011 种蛋白为两组共同表达，见图2。其中差异蛋白68 种，39 种蛋白上调，29 种蛋白下调。上调与下调前10 的蛋白见表2，差异表达蛋白火山图，见图3。

图2 两组大鼠心肌蛋白韦恩图

图3 大鼠心肌差异蛋白火山图

表2 CPR 大鼠心肌上调、下调前10 位的差异蛋白

2.3 GO 功能富集分析 在GO 数据库对差异蛋白进行分子功能（MF），细胞成分（CC），生物学过程（BP）富集分析。MF 主要富集在tau 蛋白结合，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）结合，抗氧化活性，低密度脂蛋白颗粒受体结合，细胞色素C 氧化酶活性。CC 富集在线粒体，质膜外部成分，细胞质。BP 主要富集在激素反应，正向调节T 细胞增殖，热反应，负向调节细胞蛋白代谢。

2.4 Reactome 通路富集分析Reactome 是常用于通路研究的数据库之一［4］，分析发现差异蛋白主要的集中通路见表3。

表3 差异蛋白富集主要通路（reactome pathway）

3 讨 论

本研究应用Label-free 定量蛋白组学方法对心肺复苏后大鼠心肌蛋白进行分析。心肺复苏后差异蛋白进行GO 分析发现蛋白富集部位较多在细胞线粒体，通路分析也发现三羧酸及电子传递链富及较多差异蛋白。

本研究发现心肺复苏后Ndufa1、Cox6a1 蛋白显著下调，这两个蛋白是线粒体电子传递链复合物I 的重要成分。既往研究也发现心脏骤停后早期线粒体复合物I 受损［5］。复合物I 缺陷的细胞表现出NADPH 产生的减少，降低了谷胱甘肽水平，增加了氧化应激、炎症和细胞死亡。最近研究［6］发现随着NADPH 的产生减少，苹果酸酶1（ME1）会出现过表达，并作为NADPH 的一个有效来源来挽救氧化还原失衡，本研究中的ME1 蛋白在复苏后显著升高，与最近的研究结果一致。CPR 组细胞色素C 氧化酶亚基3（COX3）显著升高，细胞色素C 氧化酶（CcO）是氧化还原酶家族的一员。CcO 是一种大型跨膜蛋白复合物，位于线粒体呼吸电子传递链的复合体IV。它能从细胞色素C 中接受4 个电子，然后传递给一个氧分子，形成两个H2O 分子，从而ATP（adenosine triphosphate，ATP）合酶产生三磷酸腺苷。因此，CcO 是一种参与多种生理和病理生理条件的重要酶［7］。研究表明心肌梗死应激导致COX3 特异性上调。COX3 过表达与细胞凋亡之间的联系。在心肌细胞中过表达COX3 导致COX1 表达减少和细胞色素氧化酶活性降低［8］。另外研究发现在缺血再灌注损伤激发前用选择性CcO 抑制剂KCN 预处理心脏，可显著减少ROS，从而减少了心肌梗死面积［9］。

我们发现上调蛋白富集在红细胞携氧及二氧化碳等通路，在红细胞内，碳酸（CA）具有促进CO2水合后转化成HCO3-和H+，促进CO2代谢［10］。本研究中发现碳酸酐酶CA1、CA2 均升高，表明心跳骤停后，由于二氧化碳潴留，机体可能存在提高CA1、CA2 含量，促进CO2代谢的代偿机制。

本研究存在一定局限性，蛋白在提取检测过程中可能发生氧化磷酸化、甲基化等影响实验的结果。另外缺少WesternBlot 等方法验证组学数据的准确性、可靠性。蛋白质含量变化不一定代表机体存在某种生理过程，因为蛋白质不一定是具有活性蛋白。

本研究发现了参与心肺复苏后心肌损伤过程的核心蛋白，并进行了差异蛋白细胞组分及通路的组学分析。发现了线粒体电子传递链复合体I 相关蛋白Ndufa1、Cox6a1、COX3、Me1 及CA 可能与大鼠心肌复苏后能量代谢障碍及二氧化碳代谢等相关。