ALDH1L2通过过氧化物酶体通路参与调控结直肠癌细胞的辐射敏感性*

李双燕，翁佳雯，俞露，丁轶

510515 广州，南方医科大学 第一临床医学院/南方医院 放疗科(李双燕、翁佳雯、俞露、丁轶)；677000云南 临沧，云南省临沧市人民医院 肿瘤科(李双燕)

结直肠癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一，据最新统计，其发病率位居全球恶性肿瘤第3位，死亡率位居第2位[1-2]。在我国，随着经济的发展，结直肠癌发病率逐年上升，已位居第2位，死亡率位居第5位[3]。目前，放射治疗是各大肿瘤诊治指南推荐的针对结直肠癌的重要治疗方法[4-7]。局部晚期直肠癌可采用新辅助放疗联合化疗作为标准治疗模式， 约2/3的患者可实现原发灶缩小、降期，并提高局控率[8-9]。 在结肠癌中，放疗可应用于初始不可切、术后残留及复发和肝肺寡转移灶等，并可使患者从放疗治疗中获益[10-11]。然而，肿瘤细胞的辐射抵抗常使得放疗达不到预期治疗效果。因此，亟需对结直肠癌辐射抵抗的分子机制进行研究，寻找有效的新靶点，最终改善患者预后。

乙醛脱氢酶家族1号成员L1亚型(ALDH1L1)是叶酸代谢中重要的酶，可参与一碳单位的循环，其启动子常甲基化导致基因低表达，是候选的肿瘤抑制因子及侵袭性癌症的潜在标记物[12-14]。乙醛脱氢酶家族1号成员L2亚型(ALDH1L2)则是ALDH1L1的线粒体同源物，两者结构功能类似，均可将10-甲酰基四氢叶酸转化为四氢叶酸和CO2，同时产生NADPH[15-17]。有报道称ALDH1L2为丝氨酸向甘氨酸转化和甘氨酸降解提供四氢呋喃，且参与依赖CoA的途径，如β-氧化，三羧酸循环和胆汁酸的生物合成等[17-19]。既往研究发现，ALDH1L2在人结直肠癌、胰腺癌组织中表达异常，且与患者的无复发生存率和总生存率相关[20-21]。因此，ALDH1L2可能参与结直肠癌的发生、发展。

过氧化物酶体通路主要包含发生在过氧化物酶体的生理、生化过程。过氧化物酶体是胞内必需的细胞器，其内包含丰富的酶类，包括氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等[22-23]。其主要参与胞内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)代谢，抗氧化及脂肪酸氧化[24-25]。而胞内氧化还原水平则与细胞辐射抗性、辐射抵抗密切相关[26-27]。

本课题组前期研究通过生信分析发现ALDH1L2在结直肠癌患者预后中发挥重要作用。既往文献报道，ALDH1L2与结直肠癌患者的奥沙利铂耐药相关[19]，但是ALDH1L2是否与结直肠癌患者的辐射抵抗相关尚未可知。因此，本研究尝试探讨ALDH1L2是否影响结直肠癌细胞的辐射敏感性，为ALDH1L2是否介导结直肠癌辐射抵抗提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

RPMI-1640培养液、胎牛血清、胰酶、Opti-MEM培养液购于美国GIBCO公司；PCR八连管、6孔平底细胞培养板购于美国NEST公司；β-Actin多克隆抗体、ALDH1L2多克隆抗体购于中国三鹰公司；彗星电泳法检测细胞损伤试剂盒购于中国凯基公司；SYBR Green荧光PCR染料购于日本Takara公司。

1.2 仪器

二氧化碳细胞培养箱、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计均购于美国Thermo公司；蛋白电泳仪、ChimiDoc XRS高灵敏度化学发光成像系统均购于美国Bio-Rad公司；荧光定量PCR仪(PRISM 7500)购于美国ABI公司；荧光显微镜购于日本Olympus公司。

1.3 生信分析

分别通过GEPIA网站(gepia.cancer-pku.cn)和肿瘤与癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库分析ALDH1L2在各种恶性肿瘤的表达情况及与结直肠癌患者生存的相关性。下载GEO数据库中的GSE17538芯片分析ALDH1L2表达水平与结直肠癌患者无疾病生存率的相关性。利用Genecards网站(www.genecards.org)对ALDH1L2基因的染色体位置和编码蛋白质定位进行分析。通过THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库分析ALDH1L2蛋白在结直肠癌患者中的免疫组化染色情况。利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)软件(www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)对TCGA中结直肠癌患者数据进行KEGG通路分析。GSEA分析中主要使用c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt数据集，设定随机组合次数为1 000次，P≤0.05的KEGG通路为显著富集通路。

1.4 细胞培养

人结直肠癌细胞HCT 116、SW480、SW620、Caco-2、RKO、HCT-15细胞在37℃、5% CO2培养箱内培养，常规方法进行传代，选择对数生长期的细胞进行实验。

1.5 RNA提取及逆转录

胰酶消化并离心得到细胞团块，加入Trizol并冰上静置使其充分裂解。1∶5加入氯仿，上下颠倒并冰上静置至分层明显。4℃，12 000 rpm 离心15 分钟，吸取上清至灭酶EP管中。加入等体积异丙醇，充分混均，静置后4℃，12 000 rpm 离心15 分钟，弃上清。使用75%乙醇洗涤RNA两次，弃乙醇，室温干燥5分钟。加入DEPC水溶解，检测RNA样品的浓度和纯度并逆转得到cDNA。

1.6 qRT-PCR检测基因表达水平

按照SYBR Green荧光染料说明书配制20 μL PCR反应体系，反应体系如表1所示，反应条件如表2所示，引物序列如表3所示。

表1 Real-Time PCR反应体系

表2 PCR反应条件

表3 引物序列

1.7 细胞转染

1.7.1 过表达质粒DNA转染 将结直肠癌细胞接种于六孔板中，细胞密度达到70%～80%时利用Lipofectamine 3000进行转染。转染48小时后，提取细胞RNA和蛋白质，进行后续实验。

1.7.2 干扰RNA转染 将结直肠癌细胞接种于六孔板中，当细胞长至70%～80%时进行转染。Si RNA序列分别为#1(5′-CTGTGTTCAAGCTTCCTAAATGG-3′)、#2(5′-CAGTTCATTCCCATGGATATAAT-3′)、#3(5′-CCCATGGATATAATTGATAGTCC-3′)，转染48 小时后提取细胞RNA和蛋白质，进行后续实验。

1.8 平板克隆形成实验

细胞转染后，按照一定数量接种于六孔板中，每组设3个复孔，分别接受2、4、6、8 Gy 6MeV X线照射，培养7～14 d。待六孔板出现肉眼可见的克隆点时甲醇固定，结晶紫染色，并拍摄平板克隆。

1.9 Western blot实验

收集细胞，提取蛋白，检测蛋白浓度，加入缓冲液煮沸变性。上胶电压65 V电泳30 min，下胶100 V电泳1 h，200 mA恒流转膜2.5 h，抗体孵育，发光显像。用Image J软件进行灰度值分析。

1.10 γ-H2AX实验

将SW480肠癌细胞暴露于8 Gy的X射线，HCT 116肠癌细胞暴露于4 Gy的X射线下；根据设定的时间梯度(0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h)收集细胞、提取蛋白、测蛋白浓度、蛋白变性，进行γ-H2AX实验。

1.11 彗星试验

X射线8 Gy照射SW480细胞，4Gy照射HCT 116细胞，培养2小时后，胰酶消化收集细胞，用彗星电泳法检测细胞损伤试剂盒，进行DNA损伤检测。碘化丙啶染色后，使用荧光显微镜拍摄彗星图像，利用CASP软件统计分析彗星头、尾的DNA占比。

1.12 细胞ROS水平检测

细胞孵育10 μM/L的DCFH-DA探针20 min后，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，对细胞进行6 Gy辐射后30 min内消化细胞成单细胞悬液，进行流式细胞学检测分析。

1.13 细胞凋亡检测

细胞进行6 Gy辐射后，使用不含EDTA的胰酶消化细胞呈单细胞悬液，PBS清洗细胞两次，加入binding buffer孵育细胞，加入Annexin-V-APC和PI，室温避光孵育15分钟，进行流式细胞学检测。

1.14 统计学方法

实验数据以数据和图表表示，测定值以均数±标准差表示。使用Graph Pad Prism 7软件进行统计学处理，组间比较采用两独立样本t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ALDH1L2与结直肠癌患者预后相关

通过对TCGA数据库中结肠癌和直肠癌患者数据进行生信分析，结果提示:ALDH1L2与结直肠癌患者的无病生存率(disease-free survival，DFS)相关，高表达ALDH1L2提示患者更短的DFS(P=0.018，HR=2.60)(图1A左侧)。同时利用GEO数据库芯片GSE17538在结直肠癌患者中进行生存分析，同样发现高表达ALDH1L2提示患者更短的DFS(P=0.03，HR=2.006，95%CI1.096～3.673)(图1A右侧)。通过Genecards网站对该基因进行生信分析，提示ALDH1L2位于12号染色体q臂23区3亚带(图1B)，其编码的蛋白质主要分布于胞内线粒体、核仁和胞浆，同时也作为分泌型蛋白分布于胞外(图1C)。利用在线开放的THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库调取了ALDH1L2蛋白在结直肠癌患者(HPA039481)中的免疫组化结果图，提示ALDH1L2蛋白主要定位于胞浆和细胞膜上(图1D)，较好地佐证了之前的生信预测结果。同时，还发现在TCGA结肠癌患者中，ALDH1L2存在2.51%的突变率，以错义突变为主；在直肠癌中有类似的结果，ALDH1L2存在1.46%的突变率，也以错义突变为主(图1E、F)。综上，提示ALDH1L2与结直肠癌患者预后相关。

图1 ALDH1L2在结直肠癌中的特性

2.2 ALDH1L2与辐射敏感性相关

为了探究ALDH1L2在结直肠癌中发挥的作用，首先检测了ALDH1L2在人源性结直肠癌细胞的本底表达情况。通过对HCT-15、HCT 116、SW480、SW620、Caco-2和RKO六株细胞进行Western blot及qRT-PCR实验，验证了ALDH1L2在多种结直肠癌细胞中存在表达，且在SW620、RKO和HCT 116细胞中表达相对较高，SW480和Caco-2细胞中表达相对较低，整体与细胞的辐射敏感性存在一定的相关性(图2)。

图2 人源性结直肠癌细胞中ALDH1L2表达水平

2.3 ALDH1L2的过表达与敲低

为了更好探究ALDH1L2在结直肠癌细胞中发挥的作用，针对SW480细胞进行了过表达，HCT 116肠癌细胞进行了敲低。质粒转染肠癌细胞株SW480后行qRT-PCR、western blot检测ALDH1L2表达量，结果提示与对照组相比实现过表达(fold change=110.1，P=0.001)(如图3A、C)。经siRNA转染肠癌细胞株HCT 116后行qRT-PCR、western blot检测ALDH1L2，发现与对照组细胞相比，1号序列及3号序列可敲低ALDH1L2(1号序列fold change=0.309，P<0.001；3号序列fold change=0.3210，P<0.001)(如图3B、D)。

图3 ALDH1L2过表达与敲低验证(***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05)

2.4 ALDH1L2是辐射敏感基因

为了探究ALDH1L2是否参与调控结直肠癌细胞辐射敏感性，我们在ALDH1L2转录水平较低且为辐射抵抗株的SW480细胞中稳定过表达ALDH1L2，在转录水平较高且为辐射敏感株的HCT 116细胞中敲低ALDH1L2，并进行平板克隆实验(图4A、B)。克隆形成后，计算SW480与HCT 116细胞的存活分数(表4、5)。结果显示ALDH1L2过表达后SW480细胞D0值升高(表4)，存活曲线左移(图4C)，提示对辐射更敏感；而敲低ALDH1L2后HCT 116细胞D0值下降(表5)，存活曲线右移(图4D)，促使细胞对辐射更抵抗。综上，体外实验提示ALDH1L2是一个辐射敏感基因。

图4 ALDH1L2过表达和敲低后进行平板克隆实验

表4 各组SW480细胞经不同照射剂量的存活分数(%)

表5. 各组HCT 116细胞经不同照射剂量的存活分数(%)

2.5 ALDH1L2抑制DNA损伤修复

为了探究ALDH1L2是否进一步影响辐射诱导的DNA损伤，检测了辐射后不同时间胞内的γ-H2AX水平。结果表明，辐射后γ-H2AX水平明显升高，在SW480细胞中1小时达到峰值，在HCT 116细胞中0.5小时达到峰值，然后随着时间的推移逐渐降低。在γ-H2AX水平达到峰值之后，SW480细胞株ALDH1L2过表达组与对照组相比下降较慢(图5A)，而在HCT 116 细胞株ALDH1L2敲低组比对照组下降较快(图5B)，验证了ALDH1L2抑制细胞的DNA损伤修复。

图5 Western blot检测SW480、HCT 116在X射线照射后γ-H2AX在不同时间点的表达水平

2.6 ALDH1L2促进DNA双链断裂

同时，还进行了彗星实验测定辐射后细胞的DNA双链断裂水平。结果提示SW480 OE细胞的彗尾明显延长，彗星头部占总DNA的比例明显降低(P<0.001，图6A)，HCT 116-Si1细胞在辐射后显示出比对照细胞更短的彗尾，头部DNA占总DNA的比例明显增加(P<0.001，图6B)。综上，提示ALDH1L2促进DNA双链断裂。

图6 彗星实验探究ALDH1L2对细胞DNA损伤水平的影响

2.7 ALDH1L2可能通过过氧化物酶体通路调控细胞辐射敏感性

结合前面数据提示ALDH1L2是一个辐射敏感基因，为了更好地探究它是通过什么途径来发挥作用，利用GSEA生信分析对TCGA数据库中结直肠癌患者进行了分析。通路富集结果提示，ALDH1L2低表达与多条通路相关，其中脂肪酸代谢通路(NES=1.68，P=0.028)与过氧化物酶体通路(NES=1.49，P=0.047)存在显著的统计学富集(图7A、B)。因过氧化物酶体是参与细胞ROS清除、调控细胞辐射敏感性的关键通路，故对过氧化物酶体通路中的关键基因进行了检测。qRT-PCR实验结果提示通路中关键基因PGC1A、SOD2和CAT呈现出显著改变。即，当ALDH1L2过表达时，上述基因转录水平降低；而ALDH1L2敲低时，上述基因转录水平增加(图7C)。在细胞进行辐射后，利用western blot实验检测了上述3个基因的蛋白水平，结果提示与转录水平变化趋势相同(图7D)。通过DCFH-DA探针结合流式细胞学检测，结果提示经过6 Gy照射后，SW480 OE细胞内呈现更高水平的ROS，而HCT 116-Si1细胞则呈现出较低水平的ROS(图7E)。通过Annexin-V-APC/PI双染细胞结合流式细胞学检测，结果提示，在辐射后SW480 OE细胞凋亡水平增加，而HCT 116-Si1细胞则呈现出相反趋势(图7F)，且反映凋亡的效应蛋白Caspase 3及cleaved-Caspase 3的表达也符合流式结果趋势(图7D)。

3 讨 论

结直肠癌是癌症死亡的重要原因之一。放射治疗是肠道肿瘤治疗的主要手段之一。既往有文献发现，与正常组织相比，结直肠癌组织中多种叶酸代谢相关酶表达异常，其中ALDH1L2常表达上调[19-21]。有学者提出，ALDH1L2与奥沙利铂耐药相关[19]，但它在肠癌放疗中发挥的作用尚并不明确。

本研究首先通过生信分析发现ALDH1L2可能与结直肠癌预后相关，其次体外实验表明ALDH1L2在肠癌细胞均有表达，且与辐射敏感存在一定相关性。根据多项研究[28-32]，提示SW480、HCT-15是相对辐射抵抗的肠癌细胞株，而SW620、RKO、HCT 116、Caco-2则是相对辐射敏感细胞。ALDH1L2在结直肠癌细胞中蛋白表达与mRNA表达水平不匹配，其原因通过查阅文献，得出可能是由于不同人源性肠癌细胞株背景不同，存在不同的突变等因素，影响到了该基因转录后的修饰，最终使得转录水平和蛋白水平不匹配[32]。本研究分别选取了SW480和HCT 116细胞株进行实验，SW480中过表达ALDH1L2会导致细胞受到的辐射损伤增加，敲低HCT 116中的ALDH1L2使细胞对辐射抵抗能力增强，最后平板克隆和彗星实验也得出类似的结论。由此可见ALDH1L2是辐射敏感基因。最后，通过GSEA分析发现ALDH1L2与过氧化物酶体通路密切相关，并通过qRT-PCR、western blot及流式细胞学检测，发现ALDH1L2可下调过氧化物酶体通路关键分子PGC1A及下游基因SOD2、CAT的转录水平和蛋白水平，使得细胞ROS清除能力降低，受照射后胞内ROS水平累积，导致细胞凋亡增多，最终使得细胞呈现出辐射敏感性增加的表型。本研究的成果在于发现了ALDH1L2是辐射敏感基因，且可能通过过氧化物酶体通路介导细胞的辐射抗性，可能在肠癌患者放射治疗抵抗的分子机制中发挥一定的作用。

但本研究也存在着不足之处。首先，我们发现ALDH1L2参与调控过氧化物酶体通路关键分子PGC1A的转录水平及蛋白水平，但具体分子机制尚不清楚。再者，本研究仅采用了SW480和HCT 116两株肠癌细胞株进行表型、功能和分子机制研究，ALDH1L2在其他肠癌细胞株中是否有同样的功能仍需进一步实验证实。

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