金纳米棒光热诱导头颈鳞状细胞癌死亡机制的研究进展*

邱有玉，张世文

650100昆明，昆明医科大学第三附属医院 头颈外科

头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是最常见的恶性肿瘤之一[1]，男性发病率显著高于女性，HNSCC在男性中的发病率和死亡率分别位于所有恶性肿瘤的第6位和第7位，是头颈部最常见的恶性肿瘤，约占头颈部所有恶性肿瘤的90%以上，并且其发病率和死亡率呈逐年上升趋势[2-3]。虽然早期HNSCC患者的预后相对较好，5年生存率约为77%～91%,但大于70%的患者就诊时为局部侵犯和(或)远处转移，患者预后较差，5年生存率仅有4%～61%[4]。据报道，尽管近几十年来外科技术的进步、辅助放射治疗、化疗方案的优化，以及近年来免疫治疗和靶向治疗的临床应用，使早期和少部分中期HNSCC患者通过手术和相应的辅助治疗干预获得较好的预后，但是大部分中晚期HNSCC患者的生存率和生活质量并没有随着治疗手段的提高而得到实质性改善[5]。并且免疫治疗和靶向药物的价格昂贵，大部分患者无力承担昂贵的医疗费用使其很难成为临床上常规的治疗方法，并且其在临床上的应用窗口较窄。因此，迫切需要探索新的有效廉价治疗方法来改善HNSCC患者的预后，提高患者的生活质量并减少毒副作用。近年来研究发现金纳米棒(gold nanorods,GNRs or AuNRs)在近红外光的照射下，其表面离子吸收光产生表面等离子共振效应(surface plasmon resonance,SPR)，将光能转化为瞬时热效应能够高效的杀灭肿瘤细胞，称为等离子共振光热疗法(plasmonic photothermal therapy,PPTT)[6]。AuNRs-SPR光热疗法在肿瘤的治疗中具有广阔的应用前景。本文综述了近年来AuNRs在肿瘤中的应用进展，并着重探讨AuNRs诱导HNSCC癌细胞的死亡机制和肿瘤的关系，为将来AuNRs在临床上治疗HNSCC提供理论依据。

1 AuNRs在肿瘤中的研究概述

近年来，随着纳米技术的迅速发展，使得人们对纳米材料的研究更加深入，研究发现金纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNP)具有独特的物理特性，功能多样，易制备，且在生物体具有独特的生物亲和效应和相对低毒等优点[7-9]。其有望为将来肿瘤的诊断和治疗带来新的变革。AuNP的形貌和尺寸可控，可根据需要将其制备成多种不同形状的AuNP，如金纳米棒、金纳米壳、金纳米球、金纳米笼、金纳米星状体和金纳米圆盘等结构，从而广泛应用于生物成像、生物传感、材料检测和疾病诊治[7]。其中，在生物医学体系中应用最广泛的是AuNRs，由于AuNRs具有由长度和宽度决定的SPR谱带，可使其谱带范围从可见光(600 nm)到近红外光(1 100 nm以上)的电磁频谱区域[9]。AuNRs由于形貌及尺寸可控、尺寸大小接近生物分子，光学可调以及独特的SPR等特性，易被叶酸、单抗等修饰后获得肿瘤靶向性，并且其沿袭了本材料的理化性质，易于制备，具有良好的稳定性，同时具备独特的生物亲和效应、光学特性和低生物毒性，使得其在恶性肿瘤诊断、治疗等领域体现出独特的优势[7]。

2 金纳米微粒在肿瘤中的应用

2.1 金纳米微粒在肿瘤诊断中的作用

临床应用的金纳米颗粒尺寸介于10～100 nm之间，具有较大的表面积，可同时结合多个或多种分子靶向配体(单克隆抗体、多肽或小分子)、放射性同位素和抗癌药物用于诊断和治疗疾病[10]。金纳米微粒具有较大的X射线吸收系数和SPR效应，可作为CT的造影剂应用于影像学疾病诊断[11]。相较于传统的全氟化纳米碳超声造影剂成像，金纳米微粒包裹的L-薄荷醇可在近红外激光照射下持续稳定地产生L-薄荷醇气泡，增强体内超声成像的对比度且超声持续时间更长，提高肿瘤的诊断及病理分型[12]。金纳米棒等离子共振效应产生较强的电磁场，可增强位于它们附近的荧光团的荧光强度，提高荧光成像和X射线计算机断层扫描双模成像检测肿瘤的准确性[13]。另外，被聚乙二醇修饰的金纳米微粒在生物体内的生物相容性更好、生物利用度和红外光的吸收效率更高[10]。肺癌细胞可分泌ENO1，在肺癌患者中水平升高[14]。研究发现耦合了ENO1抗体的金纳米颗粒复合体可作为电化学信号探针，通过肺癌患者的呼气即可检测出极低水平的ENO1，达到诊断肺癌的目的[15]。耦合了ENO1抗体的金纳米颗粒复合体是无创、简易、安全地诊断肺癌的方法,可用作诊断肺癌的特异分子生物标志物。

2.2 金纳米微粒在肿瘤治疗中的作用

辅助放化疗药物抵抗和毒副作用是当前临床工作面临的一大挑战，如何增加药物在肿瘤组织中的富集，提高杀灭肿瘤的能力并减少药物毒副作用是当前亟需解决的问题。抗体修饰的金纳米微粒能搭载多种化疗药物在肿瘤组织中特异性富集，且在达到肿瘤组织前不会被提前释放降解，避免脱靶效应，同时降低了化疗药物的给药剂量，及最小化化疗相关的副作用，从而使肿瘤组织中的有效药物浓度更高[16]。

另外，金纳米微粒在生物体内半衰期较长，可增强其通透性和滞留性作用[17]，并通过脉管系统的渗漏延长金纳米微粒在肿瘤组织中滞留时间。修饰过的金纳米微粒复合体到达目标靶位，在配体的介导下，通过细胞内化(内吞、吞噬、和胞饮)作用[18]进入细胞内释放抗肿瘤药物，达到杀灭癌细胞的目的。我们的前期研究发现，应用金纳米棒耦合表皮生长因子受体时，耦合的金纳米棒复合体能够在头颈部鳞癌细胞中靶向富集，在近红外光照射下，可诱导肿瘤细胞凋亡[19]。金纳米微粒在X线照射下，可加速癌细胞DNA链的快速断裂和损伤，促进癌细胞死亡，因此，金纳米微粒或可作为放射治疗的增敏剂。因此，金纳米棒光热效应在肿瘤的治疗中具有广泛的应用前景。

3 金纳米棒光热诱导头颈部恶性肿瘤细胞死亡机制

金纳米棒吸收近红外光并将其转换成热量，主要通过凋亡和/或坏死导致细胞死亡[20]。优化AuNRs的浓度和PPTT激光功率，实现最大程度的诱导癌细胞启动凋亡程序促进细胞凋亡，避免细胞坏死释放细胞内成分到细胞外环境，诱发炎症反应，损伤周围正常组织[21]，同时探索其作用机理非常重要，为预测和优化AuNRs光热疗法治疗恶性肿瘤提供基础。我们前期研究显示[22]，AuNRs表面修饰表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)能特异性靶向表达EGFR的Hep-2细胞，且无明显细胞毒性。在后续的相关实验研究证实，AuNRs表面修饰EGFR，浓度为280 μg/kg，PPTT激光频率为2.5 W/cm2时，实现最大程度地诱导头颈鳞癌裸鼠移植瘤模型肿瘤细胞凋亡。Ali等[8]的研究报道了类似的研究结果。

3.1 PI3K/AKT/mTOR通路诱导下咽恶性肿瘤细胞凋亡

我们实验组前期研究发现[23]，EGFRmAb-AuNPs可特异性结合高表达EGFR的下咽癌细胞。有研究显示，EGFR及其下游的PI3K/AKT/mTOR信号通路可在多种恶性肿瘤中被激活，激活后的PI3K/AKT/mTOR信号通路可抑制肿瘤细胞凋亡，导致细胞生长失控。下咽恶性肿瘤细胞在EGFRmAb-AuNPs+近红外光谱(near-infrared,NIR)处理后，AKT的Thr308和Ser473位点的磷酸化水平显著降低，磷酸化AKT Thr308位点的p-PDK1也降低，PI3K/AKT/mTOR信号通路下游靶点GSK-3β的磷酸化水平大幅度下降，其下游的Bax、caspase 3和caspase 9不被磷酸化，最终导致细胞凋亡[24]。此外，负调控PI3K/AKT/mTOR通路的p-PTEN肿瘤抑制因子[25-26]水平升高。这些数据表明，在EGFRmAb-AuNPs+NIR处理后，PI3K/AKT/mTOR通路下调，下咽恶性肿瘤细胞凋亡(图1)。

图1 PI3K/AKT通路图

3.2 DNA损伤应答通路诱导下咽恶性肿瘤细胞凋亡

前期研究还发现[23]，EGFRmAb-AuNPs可进入到下咽恶性肿瘤细胞的细胞核，在NIR照射下，ATM、BRCA1等双链DNA断裂修复因子表达水平升高，提示DNA损伤，基因组完整性被破坏，并诱导细胞凋亡。

3.3 线粒体途径诱导头颈部鳞癌细胞凋亡

三苯基膦修饰的α螺旋凋亡肽(TPP-KLA)可特异性靶向线粒体膜，诱导线粒体功能障碍，触发内在线粒体通路，释放细胞凋亡信号(如细胞色素C)，最终导致线粒体依赖性的程序性细胞死亡。研究发现阳离子肽R8和靶向线粒体的促凋亡肽TPP-KLA通过Au-S键共修饰金纳米微粒，形成AuNS-pep,并通过静电相互作用将带负电荷的透明质酸(hyaluronic acid,HA)进一步涂覆在AuNS-pep表面，以靶向肿瘤细胞。被肿瘤细胞识别内化后，AuNS-pep靶向线粒体膜，触发内源性线粒体凋亡通路，同时在NIR照射下，通过金纳米微粒的光热疗法(photothermal therapy,PTT)，线粒体受损，线粒体跨膜点位丧失，触发内在线粒体凋亡途径，诱导肿瘤细胞凋亡[27-30]。Perez-Hernandez等[31]研究发现，当AuNRs进入肿瘤细胞后，在近红外光照射下，Bid被蛋白裂解激活为有活性的tBid，tBid转运至线粒体中，诱导Bax和/或Bak寡聚(激活)，线粒体外膜通透性增高，线粒体膜电位(Ψm)损失，诱导细胞色素C释放和caspase-9激活，进而导致caspase-3激活启动线粒体通路诱导细胞凋亡[32]。我们的前期细胞学实验中也显示，Hep-2细胞中加入EGFRmAb-AuNRs,在近红外光照射后，caspase-3表达增加，数据表明，EGFRmAb-AuNRs诱导的凋亡依赖线粒体通路[22]。

3.4 NETosis途径诱导头颈部鳞癌细胞凋亡

中性粒细胞胞外捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞一种不同于凋亡和坏死的新型死亡方式，是以核内或线粒体内DNA为骨架，负载抗微生物肽及水解酶组成网状结构，包裹及杀伤外来入侵的病原体[33]。同时，NETs对病原体的捕捉固定可以增强其他白细胞的吞噬作用[34]。Ali等[8]研究金纳米棒光热效应诱导细胞凋亡的机制时，共测量了5 222种蛋白，有效蛋白1 202种，当金纳米棒介导的离子共振光热疗法运用于头颈鳞状细胞癌时，观察到组蛋白H2、组蛋白H4、IL-18和Pin1表达水平明显升高，通过IL-18[35]和染色质脱凝[36]两种途径触发NETosis途径诱导细胞凋亡。

3.5 金纳米微粒诱导其他恶性肿瘤细胞死亡机制

3.5.1 免疫激活介导肿瘤细胞的凋亡途径 当NK细胞活化后可通过释放穿孔素和颗粒酶来进行免疫监视并诱导细胞溶解，同时还可以分泌干扰素和诱导死亡受体表达，从而介导细胞凋亡[37]，因此可通过靶向 NK细胞来诱导肿瘤死亡。Jiao等[38]通过靶向肿瘤的抗GD2抗体hu14.18K322A偶联金纳米颗粒形成HGNP复合物，通过Fab片段特异性识别GD2抗原阳性的神经母细胞瘤和黑色素瘤细胞，同时功能性Fc段与NK细胞表面的FcR识别，引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，经外源途径引起肿瘤细胞的凋亡，且对GD2阴性的正常组织无毒副作用。结果表明，HGNP有望成为治疗神经母细胞瘤和黑色素瘤癌症的特异有效靶向药。Mocan等[39]通过负载了MUC-1(CD227)的金纳米颗粒(NPs)靶向腹膜巨噬细胞上呈递的肿瘤特异性抗原，增强了腹膜巨噬细胞的活化，增加其对肿瘤细胞的吞噬作用。

3.5.2 沉默热敏感基因增强光热诱导肿瘤细胞凋亡途径 应激蛋白激酶(SAPK/JNK)在光热诱导细胞凋亡中伴有重要角色，在热休克蛋白70(heat shock protein 70， HSP70)高表达的细胞中，可强烈抑制SAPK/JNK的活化，提示HSP70可通过抑制SAPK/JNK活化上游信号转导阻止细胞凋亡。然而，当细胞中HSP70持续升高时，热休克不抑制SAPK/JNK的活化，而是在SAPK/JNK活化后的某个时间点抑制细胞凋亡，阻断细胞凋亡的效应步骤[40]。因此，HSP70可通过抑制SAPK/JNK通路抑制细胞凋亡。Wang等[41]的研究显示，HSP72(siHSP72)/HA耦合金纳米微粒(GNS / siHSP72 / HA)，可有效沉默HSP72(95%)，通过金纳米微粒介导的PTT，增加肿瘤细胞的热疗敏感性，提高了恶性肿瘤的治疗效果。

4 总 结

金纳米棒是用于疾病的诊断和治疗最常用的纳米材料之一，金纳米棒在近红外光的照射下表面产生等离子共振效应，将光能转化为热能杀死肿瘤细胞。研究发现当精确控制金纳米棒的量、近红外光的照射功率和时间时，能达到诱导肿瘤细胞启动凋亡途径导致肿瘤细胞死亡的理想模型。且易于被特异抗体及抗肿瘤药物等修饰形成共轭复合物，修饰后的金纳米棒本身属性不变，但肿瘤靶向富集特异性更好，全身毒性反应较小和生物相容性更好。目前的研究发现，其可通过介导线粒体在内的多条细胞凋亡途径诱导癌细胞凋亡，但是研究成果都是基于细胞水平和动物模型，且缺乏多中心的研究数据支持，具体诱导肿瘤细胞凋亡的机制还不清楚，需要后续进一步的研究阐释金纳米棒诱导肿瘤细胞凋亡机制，金纳米棒有望成为将来治疗头颈鳞状细胞癌的特异靶向药物。

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