CC趋化因子配体22在胃癌病人外周血中的表达及意义

王晓龙 陈亮 曹洪涛 林波 汤婷婷 马克强 嵇腾飞 曹天生 王健 张文伟 杨建荣 卢卓才 由田 何青青 缪巍

胃癌是消化系统常见的消化系统肿瘤，是全球第3大肿瘤相关性死亡的原因[1]。幽门螺杆菌、饮食、遗传因素等与胃癌的发生发展密切相关[2]。巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞及其表达的细胞因子、趋化因子等在胃癌发生发展中起重要作用[3]。Chemokine(C-C motif) ligand 22(CCL22)是巨噬细胞、树突状细胞等表达的一种趋化因子，可以识别并趋化表达CCR4的T-reg细胞、Th2细胞等，抑制机体针对病原体、肿瘤细胞的免疫反应，促进病原体持续感染、肿瘤发展[4-5]。胃癌组织中CCR4表达水平增高[6]。本研究收集胃癌病人外周血标本，检测外周血中CCL22表达水平，并分析其表达水平与胃癌临床分期的相关性，研究CCL22对胃癌细胞的趋化作用，探讨CCL22在胃癌发生发展中的作用。

对象与方法

一、对象

2016年1月～2019年1月在青海大学附属医院和南方医科大学附属花都医院胃肠外科住院的胃癌病人55例，男性40例，女性15例，年龄41～65岁，平均年龄50.3岁，经病理学检查确诊。按胃癌最新分期标准分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例，Ⅳ期15例。术前检查未发现主要脏器的器质性病变，未行放化疗或生物治疗。对照组30例，男性24例，女性6例，年龄38～58岁，平均年龄48.2岁，为健康体检者。所有入组者无并发HIV、乙型或丙型病毒性肝炎，未使用免疫抑制剂，排除自身免疫性疾病。

二、方法

1.标本收集：于晨起采空腹肘静脉血10 ml，5 ml装入干燥无菌非抗凝真空管，室温静置60分钟后自行凝固，再以1 500 r/min离心12分钟，取上清用EP管分装，放入超低温冰箱保存。5 ml放入无菌含肝素的抗凝管，Ficoll密度梯度离心法分离、纯化外周血单个核细胞。

2.总RNA提取及定量PCR：细胞总RNA提取采用用Trizol试剂盒(Invitrogen公司)。细胞总RNA反转录为cDNA采用反转录试剂盒(Toyobo公司,Japan)。然后用real-time PCR Faststart Universal SYBR Green Master(Rox)试剂(Roche公司)扩增。扩增CCL22的引物如下[7]：F:5＇-ATTACGTCCGTTACCGTCTGC-3＇，R:5＇-TCCCTGAAGGTTAGCAACACC-3＇。

3.ELISA ：血清中CCL22蛋白表达水平用美国R&D公司ELISA试剂盒(货号：DMD00)检测，具体步骤按说明书操作。

4.趋化实验：用Biocoat细胞培养小室(Biocoat Invasion Chamber，BD公司)检测CCL22对胃癌细胞株SNU216的趋化作用。将5×105个胃癌细胞置入chamber上层，加入或不加入不同浓度的CCR4抗体(Santa Cruz公司)，用无血清dulbecco's modified eagle medium(DMEM)培养液培养，将CCL22蛋白加入chamber下层，将chamber放入培养箱孵育，6～24小时后Giemsa染色，光镜下计数，检测CCL22对胃癌细胞迁移的作用。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0软件分析数据。组间均数比较采用t检验或方差分析。相关性分析采用Pearson's相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.外周血中CCL22 RNA表达见图1。结果显示，胃癌组CCL22mRNA表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 两组病人外周血中CCL22 mRNA表达水平

2.外周血中CCL22蛋白质表达见图2。结果显示，胃癌组CCL22蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05) 。

图2 两组病人外周血中CCL22蛋白质表达水平

3.外周血中CCL22表达水平见表1。结果显示，胃癌组病人外周血CCL22表达水平随胃癌分期而逐渐增高。

表1 不同胃癌分期病人外周血CCL22表达(pg/ml)

4.CCL22可趋化胃癌细胞：如图3所示，CCL22呈剂量依赖性诱导胃癌细胞株SNU216迁移(图3A)。加入CCR4抗体阻断CCL22诱导的SNU216细胞迁移(图3B)。

图3 A:CCL22诱导胃癌细胞迁移;B:CCR4抗体阻断CCL22诱导的胃癌细胞迁移

讨论

本研究发现，胃癌病人外周血中趋化因子CCL22表达增高，且其表达水平随胃癌分期而逐渐增高，CCL22呈剂量依赖性诱导胃癌细胞迁移。CCL22是一种趋化因子，可以趋化Treg细胞、Th2细胞、单核细胞等，抑制机体针对肿瘤细胞的免疫反应，促进肿瘤发展[4-5]。

有研究证实，胃癌组织中Treg细胞数量增多，且Treg细胞表面CCR4表达增高[8]，而CCR4是CCL22识别并结合的受体。CCL22识别并结合表达CCR4的免疫细胞，发挥趋化作用。CCL22通过与CCR4识别、结合，趋化Treg细胞等免疫细胞聚集至胃癌组织，改变肿瘤浸润淋巴细胞的组成，在肿瘤局部发挥免疫抑制作用，有利于肿瘤的生长。因此，本研究推测针对CCL22的表达可能作为治疗胃癌的一个靶点。

有研究发现，胃癌组织中趋化因子CCL20、CCL17表达增高[1，9]，CCL20通过识别结合表达CCR6、CCL17通过识别结合表达CCR4的免疫细胞浸润至胃癌组织，参与胃癌的发病。本研究发现，胃癌病人外周血中CCL22表达增高，且其表达水平与胃癌分期呈正相关，而CCL22亦可识别并结合CCR4，发挥趋化作用。研究报道胃癌细胞表达CCR4[10]。我们利用细胞模型进行趋化实验，研究发现，CCL22呈剂量依赖性诱导胃癌细胞迁移，CCR4抗体可阻断CCL22诱导的胃癌细胞迁移。因此，CCL22可能通过识别结合表达CCR4的免疫细胞参与胃癌的发生发展，亦可能通过识别结合表达CCR4的胃癌细胞促进胃癌转移。

综上所述，胃癌病人外周血中CCL22表达增高，其表达水平随胃癌分期而逐渐增高，CCL22可趋化胃癌细胞迁移，CCL22可能参与胃癌的发生、发展、转移。