基于金纳米簇－牛血清白蛋白无酶无标记荧光探针测定芦丁的研究

周秋敏，赖艳琼，李秋旸，张艳丽*，王红斌，杨文荣，2，庞鹏飞*

（1. 云南民族大学 化学与环境学院，云南 昆明 650500；2. 迪肯大学 生命与环境科学学院，澳大利亚维多利亚州 吉朗 3217）

芦丁（Rutin）又称芸香苷、维生素P，是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于芸香叶、烟叶、橙皮、番茄、槐花米和荞麦花等植物中［1］。芦丁具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗病毒、清除自由基等生理和药理作用［2－4］，能降低毛细血管通透性和脆性，保持及恢复毛细血管的正常弹性，可用于防治脑溢血、高血压、视网膜出血、紫癜和急性出血性肾炎等疾病，也用作食品抗氧化剂、营养增强剂和色素等。随着芦丁中药材及其制剂在日常生活中的应用越来越广泛，建立快速、简便、准确的芦丁含量的测定方法具有重要意义。目前，芦丁的测定方法主要有高效液相色谱法［5－6］、毛细管电泳法［7－8］、光度分析法［9－10］、流动注射分析法［11－12］、电化学分析法［13－19］和荧光分析法［20－24］等。其中，电化学和荧光分析方法具有样品前处理简单、响应速度快、检测成本低、选择性好和灵敏度高等优点，在中药有效成分芦丁含量的测定方面得到了广泛应用。

金属纳米簇（Metal nanoclusters）是一类新型功能纳米材料［25］，是由几个到几十个金属原子组成的团簇，直径通常小于2 nm。独特的物理和化学性质，如超小尺寸、HOMO－LUMO 跃迁、强的发光性能及良好的稳定性和生物相容性，使金属纳米簇在生物传感、催化、标记、成像和治疗等领域具有广阔的应用前景［26］。金纳米簇（Gold nanoclusters，AuNCs）是一种可发射荧光的纳米团簇［27］，具有制备方法相对简便、尺寸超小、荧光较强、荧光量子产率和稳定性高等特点，成为目前倍受关注和研究最广泛的金属纳米簇，已被用于细胞成像、离子检测、化学传感等领域［28－31］。与传统的有机荧光染料和有毒的荧光量子点相比，金纳米簇具有毒性低、荧光性能稳定、生物相容性好、发射波长可调及易于制备等优点，广泛用于荧光传感分析中［27］。

本文以牛血清白蛋白（BSA）为模板，制备金纳米簇－牛血清白蛋白（AuNCs－BSA）荧光探针，构建了无酶无标记荧光分析方法用于芦丁的传感检测。采用透射电镜、紫外－可见光谱和荧光光谱表征了AuNCs－BSA 的形貌和光学特性，探索了芦丁对AuNCs－BSA 的荧光猝灭机理，优化了实验条件，研究了AuNCs－BSA荧光探针对芦丁的选择性及定量测定，并用于实际样品分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F－7000 荧光光谱仪（日本株式会社日立制作所）；TU－1950 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；JEM－2100透射电子显微镜（日本电子株式会社）。

芦丁（HPLC ≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma 公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）购自国药化学试剂有限公司；复方芦丁片购自上海朝晖药业有限公司。所用试剂均为分析纯，使用时未经进一步纯化，实验用水为无菌去离子水。

1.2 AuNCs－BSA的制备

根据文献方法［32－33］改进后制备金纳米簇荧光探针。取10 mL 50 mg/mL的BSA 溶液，置于40 ℃恒温水浴箱中10 min，剧烈搅拌下缓慢加入10 mL 10 mmol/L 的氯金酸，充分搅拌2 min 后，再加入1 mL 1 mol/L NaOH 调节溶液pH值为弱碱性，40 ℃下继续搅拌反应12 h。该过程中，溶液颜色由亮黄色变成浅棕色，最终变成深棕色，即得到AuNCs－BSA荧光探针。4 ℃避光保存，备用。实验所用玻璃仪器均用王水浸泡，并用水洗涤。

1.3 芦丁测定及实际样品分析

在优化实验条件下，向AuNCs－BSA 溶液中加入不同浓度的芦丁，用10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 6.5）稀释。设置荧光仪激发狭缝和发射狭缝均为10 nm，激发电压为600 V，495 nm 激发波长下记录520～720 nm 的荧光发射光谱。取商品化的复方芦丁1 片（20 mg/片），研磨成粉后用乙醇溶解，采用0.22 μm滤纸过滤，得到样品溶液，待测。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

AuNCs－BSA 荧光探针的制备及对芦丁的检测原理如图1 所示。以BSA 为模板，在40 ℃下调节溶液pH 值至弱碱性，以增加牛血清白蛋白的还原能力。BSA 中含有酪氨酸和半胱氨酸，具有还原性的酪氨酸，能将Au（Ⅲ）还原为Au（Ⅰ）离子及金原子，使之与半胱氨酸中的硫醇以Au—S 键结合固定在BSA 上，形成的AuNCs－BSA 具有强的荧光性能。该过程中BSA 既是还原剂也是稳定剂。当存在芦丁分子时，由于BSA 与芦丁的亲和力强于金纳米簇，金纳米簇从牛血清白蛋白中释放出来，导致体系荧光猝灭，基于此构建了一种检测芦丁的荧光生物传感器。

图1 AuNCs－BSA荧光探针检测芦丁的原理示意图Fig.1 Schematic illustration for the detection principle of rutin based on AuNCs－BSA fluorescent probe

2.2 AuNCs－BSA的表征

采用透射电镜（TEM）对制备的AuNCs－BSA 进行形貌表征。如图2所示，AuNCs－BSA 的分散度较好，尺寸分布较为均匀，平均粒径为2 nm 左右。图3 为AuNCs－BSA 的荧光和紫外－可见光谱，曲线a 为AuNCs－BSA 的激发光谱，其最大激发波长为495 nm，曲线b 为AuNCs－BSA 的发射光谱，其最大发射波长为620 nm。AuNCs－BSA 的紫外－可见吸收光谱（曲线c）中，520 nm处无吸收峰（金纳米簇的特征峰），未观察到局部表面等离子体共振峰，表明制备的AuNCs-BSA 尺寸小于2 nm 或不存在较大的金纳米粒子。如图3 插图所示，合成的AuNCs－BSA在可见光下为棕色，在365 nm紫外灯的照射下发出红色荧光。

图2 AuNCs－BSA的透射电镜图Fig.2 TEM image of the prepared AuNCs－BSA

图3 AuNCs－BSA的激发（a）、发射（b）光谱和紫外－可见吸收（c）光谱图Fig. 3 Excitation（a）and emission（b）and UV－Vis absorption（c）spectra of AuNCs－BSA

2.3 荧光猝灭效应

为了验证实验的可行性，研究了AuNCs－BSA荧光强度在加入芦丁前后的变化。如图4所示，当不存在芦丁时，AuNCs－BSA 体系在620 nm 处表现出良好的荧光信号（曲线a）；当加入60 μmol/L芦丁时，AuNCs－BSA 的荧光强度显著降低（曲线b）。实验结果表明，AuNCs－BSA可以作为荧光探针对芦丁进行定量分析。

图4 AuNCs－BSA加入芦丁前（a）后（b，60 μmol/L）的荧光光谱图Fig.4 Fluorescent spectra of AuNCs－BSA in absence（a）and presence of 60 μmol/L rutin（b）

2.4 实验条件优化

为了获得良好的荧光分析性能，对实验条件（缓冲液pH 值、反应温度和时间）进行了优化。向体系中加入20 μmol/L 芦丁，考察了pH 6.0～8.0对AuNCs－BSA荧光强度的影响。结果表明，当缓冲液pH 值为6.5 时，AuNCs－BSA 荧光猝灭强度最大，因些选择pH 6.5 的PBS 缓冲液进行实验。考察了温度（25、30、35、40、45 ℃）对BSAAuNCs荧光强度的影响，发现当温度为40 ℃时，AuNCs－BSA 的荧光猝灭最大，因此实验选择40 ℃作为反应温度。最后，考察了反应时间（5、10、15、20、25、30、35 min）对AuNCs－BSA 荧光强度的影响。结果显示，随着反应时间的增加，体系的荧光强度逐渐减小，当达到30 min 时，荧光强度趋于平稳，因此实验选择30 min作为反应时间。

2.5 方法检出限

在上述优化实验条件下，测定了AuNCs－BSA 荧光探针对不同浓度芦丁的荧光猝灭情况。结果显示，随着芦丁浓度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、60 μmol/L）的增加，AuNCs－BSA 的荧光强度逐渐减小，其荧光猝灭值（IF）与芦丁浓度（c，μmol/L）在0～60 μmol/L 范围内呈良好的线性关系，线性方程为IF=-50.2c+ 3 789，检出限（S/N= 3）为0.63 μmol/L，相关系数（r）为0.996 0。对比了本工作与已报道工作对芦丁的检测性能。由表1 可见，本工作分析性能与文献报道相当，但本工作具有荧光探针制作简单、无需标记等优点。

表1 检测芦丁不同分析方法的性能比较Table 1 Analytical performance of AuNCs－BSA fluorescent probe with other works for detection of rutin

2.6 干扰实验

实际样品分析中，存在的干扰物会影响测定结果，因此考察了AuNCs－BSA 荧光探针的选择性。实验结果表明，当芦丁浓度为50 μmol/L 时，10 倍量的Na+、Ba2+、Ag+、Zn2+、Ca2+、K+、Pb2+金属离子对芦丁测定的干扰可忽略，说明该荧光探针抗干扰能力和选择性较好。

2.7 实际样品测定

取“1.3”制备的复方芦丁样品溶液，在最优实验条件下，采用标准加入法测定AuNCs－BSA的荧光响应，平行测定3 次，结果如表2 所示。其加标回收率为99.0%～103%，相对标准偏差（RSD）小于3%，表明AuNCs－BSA荧光探针可用于实际样品中芦丁的分析测定。

表2 复方芦丁片中芦丁的测定结果（n=3）Table 2 Determined results of rutin in compound rutin tablets with AuNCs-BSA fluorescent probe（n=3）

3 结 论

本文以BSA 为模板，成功制备了AuNCs－BSA 无酶无标记荧光探针用于芦丁的传感检测。实验结果表明，该探针制备简单，且具有良好的生物相容性和高的荧光强度。根据芦丁对AuNCs－BSA 荧光探针的荧光猝灭效应，建立了荧光猝灭法测定芦丁的分析方法。该法具有灵敏、无需任何标记、操作简单的优势，可用于实际样品中芦丁含量的测定。