GOLPH3在肺癌组织中的表达及其对肺癌细胞侵袭和迁移的影响

王智园 杨曼 刘士岳 苏国苗 雷梓★

肺癌的发生及侵袭转移机制复杂，受到多种基因的调控［1-3］。高尔基磷酸化蛋白-3（Golgi phosphoprotein-3，GOLPH3），也被称为MIDAS、GPP34、GMx33，是新近发现的定位于高尔基网的具有强大转化能力的癌基因［4-6］。研究表明GOLPH3 在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种实体肿瘤组织中表达明显上调［7-10］。GOLPH3 在肺癌的发生及侵袭转移中的作用机制尚不明确，但有体外实验研究表明，封闭GOLPH3 基因后，肿瘤细胞被明显抑制，提示GOLPH3参与恶性肿瘤的发生及发展。为探究GOLPH3 是否与肺癌的发生及侵袭转移相关，本研究分析GOLPH3 蛋白表达与肺癌临床病理学特征之间的关系；构建沉默GOLPH3 的肺癌A549 细胞，以分析GOLPH3 对肺癌细胞侵袭和迁移能力的影响，为非小细胞肺癌靶向治疗提供潜在的新靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年至2020年间于昆明医科大学第一附属医院进行手术切除的非小细胞肺癌组织72例，其中61 例具有对应的远离癌的肺组织（远癌组织），远癌组织来源于距癌组织边缘5 cm 以上的肺组织。病例纳入标准：①所有病例均未行术前放化疗；②术前检查排除远处转移；③术后病理检查确诊非小细胞肺癌。排除标准：排除术后1 个月内死亡者。研究经昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准并取得患者知情同意。

1.2 材料与试剂

肺腺癌细胞A549 细胞购买于中国科学院昆明动物研究所，RPMI-1640 培养液、胎牛血清（#C04001-500）购于以色列BI（Bioind）公司，针对GOLPH3 基因特异性构建并包装的可供直接转染的慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体购自上海吉玛制药技术有限公司。RIPA（#P0013K）细胞裂解液、BCA（#P0010）试剂盒和增强化学发光ECL（P0018FS）试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；Transwell 小室购自美国Millipore 公司，Matrigel（#356234）购自美国Becton，Dickinson and Company；兔抗人GOLPH3（#abs111104）50 μL 多克隆抗体购自爱必信（absin）公司，兔抗人E-Cadherin（24E10，#3195）100 μL 和兔抗人Vimentin（D21H3，#5741）100 μL 单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学法检测组织内GOLPH3 表达

组织标本常规制片，H-E 染色，光镜下观察肿瘤形态学特征。免疫组化使用SP 法染色，一抗用GOLPH3 多克隆抗体。免疫组化结果按照IRS 评分法判断［11］：以阳性细胞数评分和阳性细胞强度评分乘积为总评分，以总评分来判断阳性等级。其中阳性细胞数≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%依次记为0、1、2、3、4 分；阳性细胞强度中不着色、淡黄色、黄色、棕黄色分别记为0、1、2、3分。总评分0～3 分、4～6 分、7～9 分、10～12 分依次记为阴性、弱阳性、阳性、强阳性。

1.3.2 细胞培养、转染与分组

将肺腺癌A549 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液中，用0.25%的含EDTA 的胰酶传代。置于37℃，含5% CO2，且饱和湿度条件下进行培养，待融合度达到80%时，0.25%胰蛋白酶进行消化传代，取对数生长期细胞进行实验。稳定转染的GOLPH3基因沉默技术构建细胞：在GenBank 中查找人GOLPH3基因mRNA 序列，根据shRAN 设计原则，利用BLAST 进行同源性分析，设计出GOLPH3-shRNA 序列。构建GOLPH3-shRNA 质粒，建立稳定转染下调GOLPH3基因A549 细胞，为GOLPH3 沉默组，转染空质粒为对照组。继续培养24 h 后通过筛选获得稳定转染干扰载体的细胞。

1.3.3 划痕实验检测肺癌A549 细胞迁移能力

将细胞接种于6 孔板，待细胞融合后，用200 μL 移液器枪头在6 孔板底部划直线，PBS 洗去细胞碎片。于0 和24 h 分别采用Olympus IX50 显微镜拍照记录细胞迁移的图像，以迁移率表示细胞的迁移能力。

1.3.4 Transwell 侵袭试验检测肺癌A549 细胞侵袭能力

采用8 μm 孔径的Transwell 小室进行细胞侵袭试验，将Matrigel 按1∶8 比例用培养基稀释后加入小室上室，在上室分别接种10 000 个GOLPH3沉默和对照组的A549 细胞，并在小室下室加入500 μL 含10%胎牛血清的培养基，置于37℃、5%CO2环境中培养24 h 后，用棉签擦拭上室内未穿膜细胞及基质胶，多聚甲醛固定，苏木素染色，显微镜下观察穿膜细胞并计数。

1.4 统计学方法

采用Graphpad prism 8.4.2 软件对数据进行统计分析和作图；计量资料以（）表示，两组间比较行独立样本t检验；计数资料采用n（%）表示，两组间计数数据用卡方检验；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GOLPH3 表达与肺癌患者临床病理因素的关系

GOLPH3 主要表达于细胞质，呈棕黄色颗粒，其中GOLPH3 在NSCLC 组中有42 例阳性，显著高于远癌组织阳性病例数（23 例）；GOLPH3 在TMN Ⅲ+Ⅳ期组和淋巴结转移组的阳性率也显著高于TMNⅠ+Ⅱ期组和淋巴结未转移组阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）。GOLPH3 的表达阳性率在年龄和性别的分组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1和图1。

图1 肺癌组织及GOLPH3 免疫组化结果（HE，×100）Figure 1 Immunohistochemical results of GOLPH3 in lung cancer tissue（HE，×100）

表1 GOLPH3 表达与肺癌患者临床病理因素的关系［n（%）］Table 1 The relationship between GOLPH3 expression and clinicopathological factors in patients with lung cancer［n（%）］

2.2 GOLPH3 沉默对肺癌细胞迁移能力的影响

划痕实验显示，划痕24 h后，GOLPH3-shRNA 组中细胞迁移率明显低于NC-shRNA 组（24.80±3.50）vs（39.17±4.74），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 GOLPH3 沉默对肺癌A549 细胞迁移能力的影响Figure 2 Effect of GOLPH3 silencing on the migration ability of lung cancer A549 cells

2.3 GOLPH3 沉默对肺癌细胞侵袭能力的影响

GOLPH3-shRNA 组中穿过基底膜的细胞数显著低于NC-shRNA 组（47.40±12.20）vs（123.00±15.70），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 GOLPH3 沉默对肺癌A549 细胞侵袭能力的影响（苏木素，×100）Figure 3 Effect of GOLPH3 silencing on invasion ability of lung cancer A549 cells（Hematoxylin，×100）

3 讨论

肺癌是目前全世界发病率最高的恶性肿瘤之一，积极探究肺癌发生及侵袭转移机制，在研究肺癌靶向治疗、控制癌变发展、延长肺癌患者生命具有重要意义［12］。癌症的发生和进展是多基因多步骤的过程，Scott KL［13］等在进行肿瘤基因组分析时发现，乳腺癌、肾癌、直肠癌等多种实体肿瘤内均存在GOLPH3 过量表达情况，确定GOLPH3 是一种原癌基因。GOLPH3 位于染色体5p13，主要存在于高尔基囊泡反面膜外围，负责高尔基分选活动。GOLPH3 在特定的病理或生理条件下被激活后，将诱导各种恶性肿瘤的发生与进展［14］。徐伟莉等［15］研究发现，结肠癌组织内GOLPH3 表达水平异常升高，且其表达水平与肿瘤远处转移、淋巴转移及临床分期等多个临床参数密切相关。为了了解GOLPH3 与非小细胞肺癌的发生发展是否存在关系，本研究结果提示，NSCLC 组织内GOLPH3阳性表达率高于远癌组织；且在有淋巴结转移和临床分期较晚的肺癌病例组织中GOLPH3 的阳性表达率显著高于无淋巴结转移和临床分期较早的病例，与文献研究结果一致。提示GOLPH3 高表达与肺癌的发生、进展和转移间存在密切关系。

在上述研究结果的基础上，笔者建立了GOLPH3 沉默的A549 细胞，在体外水平观察GOLPH3基因对肺癌细胞的影响。国内王春晓［16］等通过体外实验表明，沉默GOLPH3基因可逆转HT29 结肠癌细胞对顺铂化疗的耐药性。张利科等［17］通过重组慢性病毒方法，分别构建沉默及过表达的GOLPH3 胰腺癌细胞株，并利用过MTT 实验，伤痕愈合实验以及Transwell 实验发现，沉默GOLPH3 可有效抑制人胰腺癌细胞的增殖、侵袭及转移。国外Cecilia Arriagada 等人［18］敲低人多形性胶质母细胞瘤T98G 细胞GOLPH3 表达后发现粘着斑激酶（FAK）的自激活减少，从而促进细胞的迁移。与以上研究相似，本研究结果发现，GOLPH3沉默组A549 细胞迁移能力明显减弱，侵袭能力也明显低于对照组，推测GOLPH3 可提高A549 细胞肺癌细胞侵袭和迁移能力，结果与文献报道一致。

综上所述，GOLPH3 在肺癌组织表达高于远癌组织，且在临床分期较晚和淋巴结转移病例表达显著高于临床分期较早和淋巴结未转移的病例，在体外实验中发现GOLPH3 沉默可减弱肺癌细胞侵袭迁移能力，提示GOLPH3 可促进肺癌的进展和侵袭迁移。因此，抑制GOLPH3 过表达有望成为肺癌靶向治疗的可靠方向，但还需更进一步细致研究不同病理类型肺癌中GOLPH3 表达情况及GOLPH3 发挥作用的分子机制，为靶向治疗提供更多依据。