血浆循环肿瘤DNA基因突变检测国家参考品的应用评价

孙楠 于婷 孙晶 贾峥 曲守方 黄杰

肺癌是全世界最常见的癌症，每年约有170万人死于该疾病［1］。液体活检作为一种微创工具，可满足对包括肺癌在内的恶性肿瘤进行实时监测和个性化治疗的迫切需求。细胞循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）检测是一种较为成熟的液体活检方式，能够进行纵向监测，全面了解肿瘤的异质性。研究表明使用基于高通量测序又称二代基因测序（next generation sequencing，NGS）的ctDNA 分析的灵敏度为75%～90%，检测结果与组织检测高度一致［2-5］。2016年中国肺癌峰会专家小组会议就液体活检达成共识并指出：检测已知的、多个平行临床可药物抑制的靶点，用于发现未知基因，探索疗效监测、预后判断和发现耐药机制等，液体活检技术推荐NGS 方法［6］。

本研究使用可逆末端终止测序技术对血浆循环肿瘤DNAKRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突变检测国家参考品进行检测，用于评价基于二代测序技术平台的以血浆为检测样本的肿瘤基因突变检测试剂盒的性能。

1 材料与方法

1.1 研究对象

血浆ctDNAKRAS/NRAS/EGFR/ BRAF/MET基因突变检测国家参考品，批号：360037-201901，87支/套，4.2 mL/支，血浆样本，由中国食品药品检定研究院（中检院）提供。

1.2 仪器与试剂

Qubit DNA 定量分析仪购自美国Life technologies 公司，实时荧光定量PCR 仪购自美国Life technologies 公司，NextSeq CN500 基因测序分析仪购自杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司，微滴式数字PCR 系统购自美国Bio-Rad 公司，文库定量试剂（批号：2109868）购自美国KAPA Biosystems公司，DNA 纯化试剂盒（磁珠法）（批号：R0037）购自杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司，人类EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）（批号：R3002191001）购自杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司，NextSeq CN500 中通量测序试剂盒（批号：R0300）购自杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取与建库

首先提取ctDNAKRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突变检测国家参考品的血浆游离DNA，然后采用人类EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）对提取的血浆游离DNA进行文库构建。在样本DNA 片段两端添加接头，然后在连接酶的作用下将带有接头的DNA 片段环化。通过在突变位点附近设计背靠背式引物进行反向PCR 扩增，富集目标DNA 片段，获得线性化的PCR 扩增产物。构建的文库采用DNA 纯化试剂盒（磁珠法）试剂盒进行纯化。

1.3.2 终文库质控

终文库经过实时荧光定量PCR 检测，样品浓度不低于1 nM，方可进行下一步的上机测序。

1.3.3 测序

将文库进行混合，变性，复性后，加载于芯片上，准备测序用反应试剂，清洁和检查测序芯片，点击NextSeq Control Software（NCS）图标，NCS 初始化完成后，从NCS 的主界面点击Sequence，测序芯片舱门打开，放入芯片，当所有运行前测试都通过，点击Start，开始测序。

1.3.4 结果判读

通过生物信息软件分析，识别携带基因突变的肿瘤DNA 序列，获得相关基因突变信息。

2 结果

2.1 终文库质控结果

样品文库浓度均≥1 nM。见表1。

表1 终文库质控结果Table 1 Final library quality control results

2.2 特异性结果

对国家参考品中的阴性参考品进行检测，试剂盒声称可检测的27 种突变检测结果的突变reads 均为0 条，为突变阴性；基因融合检测，融合突变reads 数均为0 条，为融合突变阴性。见表2。对试剂盒范围外的国家阳性参考品进行检测，试剂盒声称可检测的27 种突变检测结果均为突变阴性；3 种基因融合检测，为融合突变阴性。

表2 阴性参考品检测结果Table 2 Negative reference result

2.3 单核苷酸变异（single nucleotide variant）和插入缺失突变（insertion-deletion）结果

对试剂盒检测范围内的国家阳性参考品进行检测，符合文库下机数据质量要求。对参考品的突变位点检测，突变reads 数均大于1，均为相应位点的突变阳性。见表3。

表3 阳性参考品检测结果Table 3 Positive reference result

2.4 检测限结果

对试剂盒检测范围内的1%和0.3%突变频率检测限参考品进行检测，标注的KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突变位点和其他突变位点均检出阳性。对试剂盒检测范围内的EGFR/MET基因拷贝数扩增阳性参考品进行检测，结果检出阳性。对试剂盒检测范围内的0.1%突变比例检测限参考品进行检测，根据试剂盒声称的检测限，标注的KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突变位点和其他突变位点检出（不高于0.1%突变频率）或未检出。见表4。

表4 检测限参考品结果Table 4 Detection limit reference result

3 讨论

液体活检可用于晚期癌患者或由于其它原因不能获取肿瘤组织样本的患者［7-8］，主要应用于个性化用药指导，肿瘤发展过程监测等［9］。液体活检最大的挑战是肿瘤患者体内ctDNA 浓度可低至整个循环DNA 的0.01%［10-11］，因此对于检测技术检测下限的研究很重要。有研究表明可使用细胞系或基因编辑的细胞系作为标准化的样本，对检测限附近的检出能力进行研究验证［12］。另外基于NGS 的方法检测ctDNA 时，需要使用超深测序（＞10 000×原始覆盖），以达到适合的检测限（≤0.1%）［13-14］。

目前没有关于高通量测序法检测ctDNA 的行业标准，也没有相关的国家参考品或国际参考品。据国家卫生健康委临床检验中心公布《2019年肿瘤游离DNA（ctDNA）基因突变检测室间质量评价》结果，我国各实验室ctDNA 基因突变检测总体合格率仅为80%，其中173 个假阳性突变结果、67 个假阴性结果。

为评价基于不同NGS 平台的液体活检试剂盒的质量和性能，开展ctDNA 检测标准化研究，中检院建立了血浆ctDNAKRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突变检测国家参考品（批号：360037-201901）用于相关试剂盒的性能评价，包括准确性、特异性及检测限［15］。该参考品对试剂盒检测范围内标注的基因突变位点均应检出；对试剂盒检测范围外标注的基因突变位点均不应检出；对试剂盒检测范围内的1%和0.3%突变比例检测限参考品进行检测，标注的基因突变位点均应检出。

参考品原料系提取自野生型或各种基因突变细胞系基因组DNA，经酶切打断后，加入血浆样本中。为保证国家参考品的换批连续性，本参考品通过建立永生化细胞系，获得细胞基因组DNA 作为原料。本研究的局限性在于国家参考品不包括融合突变的基因类型，因此未对试剂盒的ALK、ROS1、RET三个基因的融合突变的检测能力进行评价。

本研究是基于高通量测序平台，首先利用环化单分子扩增，获得线性化的PCR 扩增产物。然后通过对扩增产物进行高通量测序，准确识别携带基因突变的肿瘤DNA 序列，获得相关基因突变信息。该技术能够满足血浆ctDNA KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突变检测国家参考品的要求，为ctDNA 肿瘤基因检测提供了一种可靠的检测方法。

综上所述，血浆ctDNA KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突变检测国家参考品可以有效保障ctDNA 检测的准确性，可以提升相关诊断试剂的质量控制水平，有利于加快循环肿瘤DNA 检测标准化的进程。