p53、人半翼基因在宫颈癌前病变及宫颈癌中的表达及相关性分析

王博，吉婷，王林林，王敏

西北妇女儿童医院产科，西安 710061

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤，发病率较高，且 呈年轻化趋势。宫颈癌易出现侵袭、转移，恶性程度较高，患者的预后较差，晚期生存率较低。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是导致宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及宫颈癌的主要危险因素，宫颈上皮感染HPV后可通过多种生物学途径改变细胞的生物学行为，导致细胞癌变。目前，HPV感染在宫颈癌发生发展中的具体机制尚有待进一步深入研究。HPV16/18型是引起宫颈癌最多的病毒类型，HPV16/18型E6蛋白在阻止细胞凋亡和分化、控制细胞形状和信号转导方面发挥重要作用，与宫颈癌发生发展密切相关。p53蛋白是机体重要的细胞生长负调节因子，在宫颈癌组织中表达上调，且对患者的预后有一定的预测价值。人半翼基因（human wings apart-like，hWAPL）是 果 蝇 体 内

WAPL

基因在人体内的同源序列，在其他肿瘤中表达下调，仅在宫颈癌组织中特异性高表达。基于此，本研究探讨p53、hWAPL在宫颈癌前病变及宫颈癌中的表达及相关性分析，为临床宫颈癌的预防及基因治疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2020年1月西北妇女儿童医院收治的宫颈病变和宫颈癌患者。纳入标准：①均经病理组织学检查确诊为CIN或宫颈癌；②年龄≥18岁；③病历资料完整。排除标准：①既往接受过放疗、化疗；②接受宫颈物理治疗或手术治疗；③妊娠或哺乳期女性；④合并其他部位恶性肿瘤、重要器官严重损伤、自身免疫性疾病。依据纳入和排除标准，本研究共纳入67例低级别CIN患者（CINⅠ）、58例高级别CIN患者（CINⅡ～Ⅲ）、42例宫颈癌患者。CINⅠ患者年龄27～66岁，平均（45.86±8.06）岁；已婚56例，未婚11例；体重指数（body mass index，BMI）为 18.45～26.85 kg/m，平均（22.68±1.45）kg/m。CINⅡ～Ⅲ患者年龄23～69岁，平均（46.53±7.19）岁；已婚50例，未婚8例；BMI为19.38～25.19 kg/m，平均（22.51±1.64）kg/m。宫颈癌患者年龄21～63岁，平均（45.62±6.93）岁；已婚37例 ，未 婚 5 例 ；BMI为19.41～26.13 kg/m，平 均（22.30±1.85）kg/m。同期选取39例宫颈炎患者，年龄24～62岁，平均（46.29±7.53）岁；已婚33例，未婚 6例；BMI为 18.50～26.24 kg/m，平均（22.26±1.37）kg/m。四组患者年龄、婚姻状况和BMI比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫组化法检测不同组织中HPV16/18型E 6、 p53、hWAPL蛋白的表达情况

取125例CIN患者的CIN组织、42例宫颈癌患者的宫颈癌组织、39例宫颈炎患者的正常宫颈组织。切片，80℃下烤片36 h，使用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，置于98℃的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）缓冲液中煮沸3 min，自然冷却30 min，待温度降至室温，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次，每次2 min，修复抗原。阻断灭活内源性过氧化物酶，滴加一抗（HPV16/18型E6蛋白单克隆抗体、p53蛋白单克隆抗体、hWAPL免抗人多克隆抗体），置于室温下3 h，PBS冲洗3次，每次2 min，滴加二抗，37℃下孵育30 min，PBS冲洗3次，每次2 min。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色，常规脱水、透明、干燥、封片，检测HPV16/18型E6、p53、hWAPL蛋白的表达情况。

1.3 结果判定

HPV16/18型E6、p53蛋白主要定位于细胞核，hWAPL蛋白主要定位于细胞质，细胞核或细胞质出现棕黄色染色为阳性细胞，以阳性细胞所占比例进行评分，阳性细胞所占比例＜10%为（-），10%≤阳性细胞所占比例＜26%为（+），26%≤阳性细胞所占比例≤50%为（++），＞50%为（+++）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对所有数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用

χ

检验；等级资料的比较采用秩和检验；采用Spearman等级相关分析观察HPV感染与p53、hWAPL蛋白阳性表达间的相关性；以

P

＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p53、hWAPL蛋白的免疫组化结果

p53蛋白主要定位于细胞核，棕黄色颗粒状沉淀为阳性表达，在CINⅡ～Ⅲ、宫颈癌组织中染色明显，hWAPL蛋白主要定位于细胞质，棕黄色颗粒状沉淀为阳性表达，在CINⅡ～Ⅲ、宫颈癌组织中染色明显。（图1）

图1 p53、hWAPL蛋白在不同宫颈组织中的表达（DAB染色，×200）

2.2 不同宫颈组织中HPV16/18型 E 6、 p53、hWAPL蛋白阳性表达情况的比较

HPV16/18型 E6、p53、hWAPL 在正常宫颈组织、CINⅠ组织、CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织中阳性表达率均逐渐升高，正常宫颈组织＜CINⅠ组织＜CINⅡ～Ⅲ组织＜宫颈癌组织，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。HPV16/18型E6、p53、hWAPL蛋白在正常宫颈组织、CINⅠ组织、CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织中的阳性表达强度逐渐升高，正常宫颈组织＜CINⅠ组织＜CINⅡ～Ⅲ组织＜宫颈癌组织，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表1、表2）

表2 不同宫颈组织中HPV16/18型 E 6、 p53、hWAPL蛋白阳性表达率的比较[ n（%）]

表2 不同宫颈组织中HPV16/18型 E 6、 p53、hWAPL蛋白阳性表达强度的比较

2.3 合并与未合并HPV感染宫颈癌患者 p53、hWAPL蛋白表达情况的比较

206例宫颈疾病患者中，合并HPV感染117例，未合并HPV感染89例。合并HPV感染患者p53、hWAPL蛋白的阳性表达率均明显高于未合并HPV感染患者，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（表3）

表3 合并与未合并HPV感染宫颈癌患者 p53、hWAPL蛋白阳性表达率的比较[ n（%）]

2.4 不同宫颈组织中HPV感染与 p53、hWAPL表达情况的相关性

Spearmen相关分析结果显示，HPV16/18型E6蛋白的阳性表达与p53、hWAPL蛋白的阳性表达均呈正相关（

r

=0.635、0.701，

P

＜0.01）。p53蛋白的阳性表达与hWAPL蛋白的阳性表达呈正相关（

r

=0.763，

P

=0.000）。

3 讨论

宫颈癌的发生机制较为复杂，是早婚早育、肿瘤基因、病毒感染及性生活混乱等多个因素共同作用的结果。多数学者认为，HPV感染是最有公认度的宫颈癌高危因素，长期HPV感染会加速宫颈癌前病变恶变为肿瘤。

HPV是最广泛的性传播环状双链DNA病毒，有超过100种基因型。国内外研究发现，宫颈癌前病变及宫颈癌的发生发展均与HPV感染密切相关，HPV阳性表达率随着宫颈病变程度的加深而逐渐升高。本研究分析不同宫颈病变患者的HPV感染情况发现，HPV在正常宫颈组织、CINⅠ组织、CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织中的阳性表达率及阳性表达强度均逐渐升高，即正常宫颈组织＜CINⅠ组织＜CINⅡ～Ⅲ组织＜宫颈癌组织，与上述研究结果一致，表明HPV感染可以促进宫颈癌前病变及宫颈癌的进展，加重病变分级。这可能是因为HPV感染会明显增强端粒酶逆转录酶mRNA的水平，进而提高端粒酶活性，促进CIN向宫颈癌的进展，最终使其表达在分级上具有差异。

癌变过程中，HPV并非单独作用，还受其他因素的影响，发挥协同作用。HPV由2个晚期蛋白及6个早期蛋白组成，早期蛋白可以调控基因组的复制和转录，其中E6蛋白与细胞转化及致瘤性紧密相关。HPV16/18型E6蛋白可与p53相互作用，使p53蛋白降解而失去抑癌作用，增加宿主细胞发生恶变风险。国外研究认为，

p53

基因是与人类肿瘤发生发展密切相关的基因，p53蛋白是重要的细胞生长负调节因子，能够影响细胞周期、血管生成、细胞分化及凋亡过程。临床研究发现，

p53

是重要的抑癌基因，可以通过抑制DNA聚合酶功能、阻碍多核苷酸延伸，发挥抑癌作用。p53可与细胞周期蛋白结合，抑制依赖细胞周期蛋白的相关激酶，导致细胞程序性死亡，消除可能癌变的异常细胞。但

p53

基因突变后会丧失正常的生理功能，使其具有原癌基因活性，从而促进肿瘤细胞的发生发展过程。本研究结果显示，p53蛋白的阳性表达率及阳性表达强度在正常宫颈组织、CINⅠ组织、CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织中均逐渐升高，与李桂湖的研究结果一致，提示p53异常表达与宫颈癌的发生发展密切相关。

WAPL

基因最早在果蝇体内发现，其编码的蛋白质可以管理异染色质结构，有利于维持姐妹染色单体的结合。

WAPL

发生变异时，染色单体各自的凝集和分离不会受到影响，但会阻碍姐妹染色单体的并列及靠近。

hWAPL

是

WAPL

在人体内的同源序列，其具体作用可能与染色体的稳定有关。Nunobiki等的研究发现，宫颈癌组织中

hWAPL

mRNA的相对表达量明显高于癌旁组织及正常组织，推测

hWAPL

的表达可反映宫颈病变情况。本研究结果发现，hWAPL蛋白阳性表达率及阳性表达强度在正常宫颈组织、CINⅠ组织、CINⅡ～Ⅲ组织和宫颈癌组织中逐渐升高，表明

hWAPL

可能是宫颈癌特异性高表达基因，在宫颈癌前病变及宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。李明伟等的研究发现，宫颈癌的发生与hWAPL的表密切相关，佐证了本研究结果。本研究结果显示，合并HPV感染患者p53、hWAPL蛋白的阳性表达率均明显高于未合并HPV感染患者；进一步相关分析发现，HPV16/18型E6蛋白的阳性表达与p53、hWAPL蛋白的阳性表达均呈正相关，提示HPV感染会上调宫颈癌组织中p53、hWAPL的表达。这可能是因为，HPV双链结构中的HPV16/18型E6蛋白能与p53蛋白结合，从而降低p53蛋白的活性，甚至失去活性，发生降解，导致宫颈细胞增殖失控，诱发宫颈癌。有研究发现，HPV蛋白中E6/E7表达的逆转录病毒导入源自人体上皮角质细胞中后会使

hWAPL

基因的表达上调。本研究还发现，宫颈癌组织中p53蛋白的阳性表达与hWAPL蛋白的阳性表达呈正相关，提示p53、hWAPL可能通过相互作用促进表达而参与宫颈恶性病变进展。

综上所述，合并HPV感染的宫颈癌患者宫颈癌组织中p53、hWAPL的阳性表达率和表达强度均较高，HPV16/18型E6蛋白的阳性表达与p53、hWAPL蛋白的阳性表达均呈正相关。