99mTc- 3PRGD 2SPECT显像在大鼠乳腺癌新辅助化疗中的疗效评估△

杨鹏杰，杨昊，何鑫，郭艳，王荣花，徐宏魁，武瑜#

内蒙古自治区肿瘤医院（内蒙古医科大学附属人民医院）1胸外科，2放疗科，3核医学科，4乳腺肿瘤科，呼和浩特 010010

新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）在局部晚期乳腺癌治疗中，具有缩瘤降期、改善远期预后等优势。循证医学证据显示，如果乳腺癌NAC可以达到病理完全缓解（pathologiccomplete response，PCR），那么其生存率将会明显提高。因此，如何有效且准确评价NAC疗效是评估最佳手术时机和调整化疗方案的重要前提。目前临床上评价NAC疗效主要是通过临床查体或超声、MRI等影像学检查手段，但公认的金标准仍然是病理检查，由于病理检查的有创性和疗效评估的滞后性等，临床上并未广泛采用，因此找到一个无创且灵敏度和特异度较高的评价手段显得尤为重要。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的多肽（Arg-Gly-Asp，RGD）与细胞整合素αβ是天然的受体配体，在肿瘤新生血管形成中起到了重要作用。Tc-RGD已被用于肿瘤新生血管的检测，Tc-3PRGD是新型的Tc标记RGD显像剂，已被证实其灵敏度和特异度均较高。本研究旨在通过Tc-3PRGD单光子发射计算机断层扫描（single-photon emission computed tomography，SPECT）显像，探讨其对大鼠乳腺癌模型NAC效果的评估价值，为临床准确评价NAC疗效、调整化疗方案及决定最佳手术时机提供实验数据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和药品

SPECT，荧光显微镜，小动物体表超声诊断仪，Tc-3PRGD，表柔比星，多西他赛，环磷酰胺等。

1.2 实验动物及乳腺癌大鼠模型建立

选取体重190～210 g雌性SD大鼠53只，生产许可证号为SCXK（京）2012-0001。常规进行Walker-256肿瘤细胞培养，培养环境为含10%小牛血清1640培养液在37℃、5% CO浓度培养箱，当细胞培养达到80%～90%时，取细胞悬液进行种鼠腹腔内注射（细胞数约1.0×10/ml），1周后可形成腹腔积液瘤。抽取并调节腹腔积液肿瘤悬液细胞浓度至4.0×10/ml。使用10%水合氯醛进行大鼠腹腔麻醉，于左侧腋窝皮下进行肿瘤接种。53只雌性SD大鼠中48只为实验组，皮下缓存注射Walker-256肿瘤细胞悬液0.8 ml左腋窝注射；5只为空白对照组，给予生理盐水0.8 ml左腋窝注射。待大鼠肿瘤最大直径达到1.0 cm时行SPECT、彩色多普勒超声及细针穿刺活细胞检查。

1.3 实验方法

乳腺癌大鼠造模成功后，NAC前行细针穿刺活检，NAC后取下组织标本，行苏木精-伊红（hematoxylin and eosi，HE）染色，观察新生血管情况及肿瘤在治疗前后退缩情况。当乳腺癌模型大鼠查体及超声检查示肿瘤体积达到1 cm时开始治疗，每周给药1次，共4次，根据目前乳腺癌常用化疗方案（蒽环类联合紫杉类化疗方案）进行，其中表柔比星12.36 mg/kg，多西他赛9.27 mg/kg，环磷酰胺61.80 mg/kg，于大鼠尾静脉注射，治疗结束后1周处死所有大鼠。

1.4 观察指标及评价标准

定量分析乳腺癌模型大鼠NAC前后Tc-3PRGDSPECT显像各项技术指标（T/NT、T/NT），分析NAC前后乳腺癌模型大鼠彩色多普勒超声检查各项技术指标（肿块的形态、与周围组织是否存在明显边界、是否含有包膜、肿瘤周边、内部、后方回声情况及彩色多普勒超声观察血流显像并进行血流信号分级），以病理学诊断为金标准，评价Tc-3PRGDSPECT显像及彩色多普勒超声检查对NAC疗效的诊断效能。①以NAC前测得的肿瘤最大直径为基线，根据实体瘤疗效评价标准1.1版（response evaluation criteria in solid tumor version 1.1，RECIST 1.1）评估 NAC 的疗效，完全缓解（complete response，CR）：全部肿瘤消失；部分缓解（partial response，PR）：肿瘤最大直径与基线相比缩小≥30%；病情稳定（stable disease，SD）：肿瘤最大直径与基线相比缩小＜30%或增加＜20%；疾病进展（progressive disease，PD）：肿瘤最大直径与基线相比增加≥20%。②病理评价标准：根据Miller and Payne病理反应分级标准将NAC前活检病理切片和NAC后病理切片进行比较，根据肿瘤细胞消退状况分为5级，1级为局部肿瘤细胞出现变化，但总体数目未变；2级为肿瘤细胞数目减少＜30%；3级为肿瘤细胞数目减少30%～90%；4级为肿瘤细胞数目减少＞90%；5级为无浸润性肿瘤成分。其中将1级与2级定义为无效，3～5级为有效。③彩色多普勒超声血流信号分级：依照Adler分级标准，将肿瘤的血流信号分为0～Ⅲ4个等级，0级表现为病灶内未见血流；Ⅰ级表现为少量血流，可见1～2处点状血流或棒状血流信号；Ⅱ级表现为中量血流，可见3～4处点状血流信号或1条长度超过或接近肿块半径的血管；Ⅲ级表现为丰富血流，可见≥3条血管或血管相互连通，交织成网状。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 实验组大鼠一般情况

2周后，实验组48只大鼠中40只肿瘤造模成功，成瘤率83.33%（40/53），5只未见肿瘤成团、左腋窝无明显肿物，死亡3只。NAC后，40只造模成功大鼠中死亡4只，2只为CR，33只为PR，1只为SD，未见PD大鼠。实验组大鼠NAC后肿瘤最大直径为（0.52±0.06）cm，明显小于NAC前的（1.13±0.18）cm，差异有统计学意义（

P

＜0.01）。

2.2 大鼠99mTc- 3PRGD 2SPECT显像情况

实验组大鼠NAC前后左侧腋窝部位T/NT值、T/NT值均高于空白对照组，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。实验组大鼠NAC后左侧腋窝部位T/NT值、T/NT值均低于NAC前，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）（表1）。空白对照大鼠全身显像剂分布正常，左侧腋窝部位注射生理盐水后未见异常显像剂摄取增高（图1A）；实验大鼠给予左侧腋窝接种肿瘤细胞造模成功后可见显像剂异常摄取（图1B）；实验组造模成功大鼠NAC治疗后可见显像剂摄取明显下降（图1C）。

表1 大鼠99mTc- 3PRGD 2SPECT的显像情况（±s）

图1 空白对照及实验大鼠99mTc- 3PRGD 2SPECT显像图

2.3 大鼠彩色多普勒超声检查情况

彩色多普勒超声检查结果显示，实验组大鼠造模成功后表现为肿瘤呈不规则团块，边界不清楚，形态不规则，内可见回声不均匀，部分肿块周边可见强回声带，内部回声偏低、不均匀，有点簇状强回声钙化灶。彩色多普勒血流显像（color doppler flow imaging，CDFI）显示，肿物周边及内部探及丰富、杂乱条状或星点状血流信号，Adler分级为Ⅲ级。实验大鼠NAC后肿瘤直径较NAC前明显缩小，CDFI显示，与NAC前相比血流信号减少，Adler分级为0～Ⅰ级。（图2）

图2 空白对照及实验大鼠超声显像图

2.4 实验组大鼠NAC前后病理染色情况

实验组大鼠NAC前肿块大体呈不规则或结节状，切面灰白或灰粉，可见灰白条纹，质地硬，镜下可见肿瘤细胞呈索状、梁状、团块状、腺管状、实性片状等；细胞较大，成不同形状；细胞核明显多形性，核仁明显，可有多个核仁，核分裂像不等；肿块间质为浸润的淋巴细胞坏死和钙化等；部分累及脉管或神经，肿瘤新生血管明显。实验组33只大鼠NAC后肿瘤明显缩小，光镜下残余浸润性肿瘤部分表现为纤维间质内散在的条索状、巢状或单个的肿瘤细胞。NAC后，1只大鼠表现为较大的片状癌巢，其余多数大鼠肿瘤间质表现为纤维化或纤维黏液样，伴有不等的淋巴细胞、组织细胞、多核巨细胞浸润，可见钙化形成及含铁血黄素沉着，部分肿瘤坏死后可形成胆固醇结晶，肿瘤新生血管明显减少。（图3）

图3 实验组大鼠NAC前后病理染色情况（HE染色，×20）

3 讨论

2020年全球肿瘤数据显示，乳腺癌在女性人群中的发病率已经超过肺癌，是目前女性最常见的恶性肿瘤。中国女性乳腺癌发病率也居首位，占女性各种肿瘤的7%～10%。NAC是局部晚期乳腺癌治疗的有效手段，并且可以使患者明显受益，但由于不同NAC方案引起肿瘤降期不同，并不能让所有乳腺癌患者都达到远期获益。Cao等的研究认为，乳腺癌患者接受NAC后，35%患者肿瘤消失达到CR，仅9%的患者达到PCR。目前评价NAC后肿瘤缓解最有效的方法是病理学检查，而病理学有创操作给患者带来较大的痛苦，同时也限制了其在临床上的应用。因此，利用无创方法准确评估乳腺癌患者NAC后疗效及手术时机把握尤为重要。

已有大量文献证明肿瘤的生长与肿瘤新生血管有关，Batlle等通过抑制间充质干细胞p38α激酶活性可使血管新生明显，进而增加了小鼠结肠肿瘤的发生率。Nuevo-Tapioles等研究发现，Nebivolol作为β1受体阻断剂可抑制内皮增殖进而抑制肿瘤血管生成，从而限制了结肠癌和乳腺癌的生长。Zhou等研究发现，杨梅素可下调血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）2和p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），其具有明显抑制肿瘤血管生成的作用，进而抑制乳腺肿瘤的生长。本研究结果显示，大鼠乳腺癌形成后病理切片显示肿瘤新生血管明显，而给予化疗药物治疗后肿瘤直径缩小，新生血管明显减少，说明乳腺癌的发生与肿瘤新生血管密切相关，并且彩色多普勒超声显示NAC前CDFI中肿物周边及内部探及丰富、杂乱条状或星点状血流信号，Adler分级为Ⅲ级，NAC后超声探及肿瘤大小较NAC前明显缩小，CDFI：与治疗前相比血流信号减少，血流信号减少，Adler分级为0～Ⅰ级。RGD是构成骨桥蛋白的一种生物活性多肽，近年研究认为其参与多种生物学过程，如新生血管形成、肿瘤发生侵袭转移、免疫调节等。研究显示，RGD介导的生理功能通过与细胞表面的整合素αβ结合发挥作用。αβ是参与细胞间粘附和信号转导的重要物质，在肿瘤增殖、转移、分化、凋亡起着重要作用。多项研究表明，αβ在乳腺癌新生血管形成中有重要作用，且αβ表达于各种乳腺癌细胞，并与肿瘤新生血管数目呈正相关，而在正常组织不表达或很少表达，提示其与乳腺癌新生血管形成有关。Engebraaten等用免疫组化分析发现利用抗整合素单克隆抗体能有效阻止新生血管内皮细胞αβ的表达，导致内皮细胞的凋亡和血管的消退，乳腺癌细胞生长受到抑制。更进一步的研究发现，阻断RGD和整合素αβ结合可明显减少鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的形成，而对已生成的血管没有影响。总之，RGD与乳腺癌病理过程的发生、发展和预后密切相关，RGD与整合素αβ结合将为乳腺癌的诊治提供靶点。

Tc-3PRGD能特异与细胞整合素αβ结合并在SPECT显像，该技术用于肿瘤新生血管的检测，并被证实是灵敏度高和特异性好的方法，对肿瘤微环境及形态的变化可以进行早期、微观及宏观的评估。Tc-3PRGDSPECT在多种疾病的早期诊断中都有应用，Wu等认为Tc-3PRGDSPECT可以通过对相关滑膜新生血管的成像发现早期类风湿性关节炎，并可应用于疾病管理中。Zhang等研究发现，Tc-3PRGDSPECT可提供一种非侵入性肝纤维化分级和评估肝纤维化逆转的方法。有研究表明，使用Tc-3PRGD探讨乳腺癌NAC后患者评价治疗反应时，Tc-3PRGDSPECT在第一个周期NCT后的灵敏度、特异度和阴性预测值分别为86.7%、85.7%和86.7%，在第二个周期NCT后的灵敏度、特异度和阴性预测值分别为92.9%、93.3%和93.3%；其中人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性组T/NT值高于其他乳腺癌亚型，且T/NT值变化较大（

P

＜0.05），HER2阳性组中T/NT值的变化与肿瘤病理反应有很强的相关性（

P

＜0.03），说明Tc-3PRGDSPECT显像可较好地评价乳腺癌NAC后疗效的无创方法。本研究利用Tc-3PRGDSPECT显像观察实验组大鼠NAC治疗前后显像剂摄取变化，结果显示，实验组NAC前后大鼠左侧腋窝部位T/NT值、T/NT值均高于空白对照组，但均低于NAC前，与病理学检查结果基本一致，因此，Tc-3PRGDSPECT可为早期评估乳腺癌NAC疗效提供更多的理论依据。

综上所述，Tc-3PRGDSPECT显像可以较好地评价乳腺癌NAC后的疗效，与病理学检查相比，其是一种无创的诊断方法。但本研究也存在一些不足，如病理学研究只是在原先实验基础上和文献报道上，未能行免疫组织化学染色进一步说明αβ的表达情况。由于造模大鼠较少，实验结果可能存在一定偏倚，今后的临床和科研工作中应进一步探索及验证。