后海穴3种针术对便秘大鼠肠神经递质的影响

王海燕，李 硕，马爱团 (河北农业大学 中兽医学院，河北 保定 071001)

便秘是兽医临床常见病，西医治疗常用莫沙必利，该药为5-羟色胺4受体(5-HT4R)激动剂，通过刺激胃肠运动，改善胃肠道症状，但长期使用效果并不理想。针灸治疗便秘疗效确切，且复发性低[1]。后海穴(GV-1)是兽医临床治疗便秘的主要穴位[2]，GV-1位于动物尾根与肛门之间，操作方便，各种针术(如白针、火针、水针、电针及激光针)均有相关报道[3-5]。但是不同针术的疗效比较及其相应的作用途径和机理尚不明确。

血管活性肠肽(VIP)作用于平滑肌，可影响胃肠黏膜分泌液体；存在肠肌间神经丛的P物质(SP)调控胃肠道运动；5-羟色胺(5-HT)是肠神经系统中重要介质[6]，与不同受体结合产生不同作用。在胃肠道中，5-羟色胺3受体(5-HT3R)主要分布于平滑肌细胞、肠神经元、迷走神经和脊髓初级传入神经元[7]，在突触间隙与5-HT结合后，引起神经递质的分泌和释放增加。5-HT4R主要分布于平滑肌细胞和肠神经元中[8]，参与蠕动反射，激活后也可导致中间神经元与运动神经元释放乙酰胆碱，从而促进胃肠运动[9]。CHEN等[10]研究证实5-HT重摄取转运体(SERT)基因敲除的小鼠出现的水样泻，可能是增强了5-HT信号通路的作用，而便秘的发生是由于5-HT过度释放导致5-HT受体不敏感。

本试验应用后海穴，选择临床常用的白针、水针和埋线，通过盐酸洛哌丁胺建立便秘模型，比较3种针术对便秘的治疗效果，明确不同针术对便秘大鼠肠道传输功能的影响，同时探索不同针术对神经递质的作用以及对5-HT信号途径的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物成年清洁级SD大鼠60只，购自北京斯贝福有限公司。

1.2 药物盐酸洛哌丁胺胶囊(2 mg/粒，西安杨森制药有限公司)，枸橼酸莫沙必利分散片(5 mg/片，浙江京新药业股份有限公司)，VB12，速眠新。

1.3 主要试剂TB Green Premix ExTaqTM荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司，5-HT3R、5-HT4R、SERT定量PCR引物购自北京六合通经贸有限公司，总RNA提取试剂盒、SP、VIP、5-HT ELISA试剂盒购自北京普洛麦格生物技术有限公司。

1.4 模型制备饲养条件为室温22～24℃，湿度50%～60%，12 h交替照明，大鼠自由饮食。适应性饲养1周后，体质量为(215±10)g，抽签随机分为A～F组，分别为对照组、模型组、西药组、白针组、水针组、埋线组。参照文献[11]的方法复制便秘大鼠模型，除对照组灌服生理盐水外，其余5组均予盐酸洛哌丁胺混悬液灌胃3 mg/(kg·d)，每天上午1次，直至试验结束。

1.5 动物处理在上述模型制备基础上，每天下午进行不同处理，连续7 d。由图1可见，其中对照组和模型组在大腿内侧肝经和肾经循行路线之间的非穴位处(该部位穴位较少，远离脾经和胃经)进行白针刺激。西药组用莫沙必利(蒸馏水配成1 g/L悬浊液)1.3 mg/(kg·d)灌胃。白针组在后海穴(尾根和肛门之间的凹陷)用0.25 mm×25 mm一次性针灸针(北京中研太和医疗器械有限公司)刺入穴位，维持20 min，每10 min进行1次捻转提插行针，针刺后大鼠放回鼠笼，维持自然放松状态。水针组在后海穴注射0.1 mL VB12。埋线组将0.2 mm酒精浸泡消毒的可吸收羊肠线埋入后海穴。除埋线组单次治疗外，其他各组每天1次。

A.白针；B.水针；C.埋线图1 动物处理

1.6 指标检测

1.6.1肠道传输功能检测与粪便数量的比较 动物处理7 d后，收集各组大鼠的粪便进行计数。禁食24 h后，墨汁2 mL/只灌胃，20 min后肌肉注射速眠新0.08 mL/kg，开腹分离肠系膜暴露肠管，剪取幽门至回盲部肠管，轻轻拉成直线，测量小肠总长及墨汁在小肠的推进长度，计算各组墨汁在小肠的推进率。

墨汁推进率=墨汁推进长度/小肠总长度×100%。

1.6.2结肠组织中5-HT、SP、VIP的含量 釆集各组大鼠结肠组织，生理盐水冲洗肠道，置于-80℃保存，利用ELISA试验检测结肠组织中5-HT，SP，VIP的含量。

1.6.3Q-PCR测定结肠组织中5-HT3R，5-HT4R，SERT mRNA的含量 使用总RNA提取试剂盒从结肠中提取RNA，逆转录得到cDNA。通过实时定量荧光PCR方法检测结肠中5-HT3R，5-HT4R，SERT的mRNA转录水平，引物由TaKaRa设计合成(表1)。预变性处理为95℃ 30 s，扩增进行40个循环，包括95℃ 5 s，60℃ 30 s。内参基因为β-actin，由2-ΔΔCt计算每个基因的相对转录水平。

表1 实时定量 PCR引物信息

2 结果

2.1 大鼠表现与空白组大鼠相比，模型组大鼠出现食欲下降，粪便颗粒减少、便粒黑小、没有光泽，精神不振、活动度下降，毛色无光。3个针刺组及西药组大鼠的表现比模型组均有所好转，进食量及活动度增加、皮毛有光泽、排便增多、粪便颗粒增大、有一定光泽度。各组粪粒比较见图2。

A.对照组；B.模型组；C.西药组；D.白针组；E.水针组；F.埋线组图2 大鼠20粒粪便长度比较

2.2 大鼠结肠组织结构各组大鼠结肠黏膜完整，未见炎性细胞浸润，黏膜上皮层细胞呈单层柱状，细胞排列整齐。A组固有层肠腺结构完整，肠腺长而直，有肠腔，腺上皮有杯状细胞(黑色箭头所指)，且分布均匀，细胞形态完整；B组固有层少量肠腺结构不完整，杯状细胞破损或消失，细胞基质增大；C～F组固有层杯状细胞与肠腺结构清晰完整，细胞基质均匀(图3)。

A.对照组；B.模型组；C.西药组；D.白针组；E.水针组；F.埋线组；黑色箭头.杯状细胞;红色箭头.肠腺图3 3种针术对大鼠结肠组织结构的影响(400×)

2.3 大鼠粪粒数量与小肠推进率模型组小肠推进率显著低于对照组(P<0.01)，白针、水针与埋线3组均提高小肠推进率，达到西药组水平，与对照组无显著性差异。

与对照组比较，模型组大鼠的粪便粒数减少29.5%；与模型组相比，西药组提高23.2%，白针组提高18.7%，水针组提高31.3%，埋线组提高25.9%，以水针组最佳(表2)。

表2 3种针术对便秘大鼠小肠推进率和粪便粒数的影响

2.4 3种针术对大鼠结肠组织中神经递质的影响对于结肠组织中VIP、SP、5-HT的水平，由表3结果可见,与对照组比较，模型组SP降低40.6%，有极显著性差异(P<0.01)；与模型组相比，西药组、白针组、水针组和埋线组均上调SP的水平，分别提高55.0%，40.6%，58.5%，60.6%，其中水针组与埋线组效果最佳，优于西药组。与对照组比较，模型组结肠组织中VIP的水平有极显著性差异(P<0.01)；与模型组相比，西药组、白针组、水针组和埋线组均下调VIP的水平，分别降低26.4%，23.5%，14.7%，25.4%，白针组和埋线组效果可达到西药组效果。模型组结肠组织中5-HT水平显著高于对照组(P=0.012)；与模型组比较，西药组和埋线组可显著下调5-HT水平(P=0.014和0.021)。

表3 3种针术对便秘大鼠肠道组织5-HT、SP 、VIP水平的影响

2.5 3种针术对大鼠结肠组织中5-HT3R、5-HT4R、SERT mRNA转录水平的影响结果显示，与对照组比较，模型组大鼠结肠组织中5-HT3R、5-HT4R、SERT mRNA的转录水平均呈下降趋势(P<0.01)，各治疗组的转录水平上升(P<0.01或P<0.05)，3个针刺组的5-HT3R转录水平与西药组无显著性差异，其中埋线组最佳；同时各针刺组SERT的转录水平优于对照组(P分别为0.126，0.064，0.047)，以埋线效果最佳；埋线组的5-HT4R转录水平显著高于C、D、E组(P分别为0.006，0.004，0.015)(图4)。

图4 3种针术对结肠组织5-HT3R(A)、5-HT4R(B)、SERT(C) 表达水平的影响

3 讨论

便秘是动物临床常见疾病，严重降低动物的生活质量。GV-1是督脉的起始穴位，同时是肛门、阴门的局部穴位。研究表明，GV-1广泛治疗各种动物消化系统和生殖系统的疾病[12-15]。研究证实，针刺GV-1可上调腹泻家兔血浆VIP含量，下调SP含量[16]，有效缓解腹泻，同时针刺GV-1还广泛治疗动物便秘[17]，因此GV-1具有双向调节作用，治疗多种消化系统疾病。

本研究结果显示，3种针术均可改善肠道传输功能，有效缓解便秘。针刺后结肠组织中VIP 含量较模型组大鼠显著下降，以水针效果最佳；而SP含量较模型组明显升高，以埋线组效果最佳，与西药组有显著性差异。已有研究表明，便秘的发病机制与胃肠神经递质的改变有关[18]，针灸治疗便秘可有效改善结肠动力[19-20]。SP 能有效促进肠道平滑肌的收缩，并可刺激肠道黏膜分泌水和电解质，从而促进胃肠蠕动[21]。VIP 是一种抑制性神经递质，其参与肠道舒张，调节肠道水液代谢，降低结肠和直肠的紧张性[22]，本试验证实，3种针术均可调节结肠组织中SP和VIP水平，改善肠道功能。

实时定量荧光PCR结果表明，与模型组相比，3种针刺方法均上调5-HT3R、5-HT4R、SERT转录水平，与西药组无显著性差异，但不同针刺方法的结果有一定差异。埋线是在传统针灸的基础上进行的改良和延伸，研究证实埋植羊肠线对穴位进行持续刺激，进而调节机体的内分泌系统，促进胃肠运动以达到通便作用[23]。本试验GV-1埋线显著调节5-HT在转录水平的表达。5-HT 在肠道运动、分泌和感觉功能中起着重要作用[24]，有研究表明便秘发病原因与5-HT信号通路改变有关[25]。对便秘小鼠进行穴位电针，能够上调5-HT3R、5-HT4R、SERT的mRNA转录水平，调节便秘[26]，本试验结果与报道一致，通过针刺调节5-HT信号通路的异常，SERT的表达上升，5-HT重摄取速度加快，降低结肠作用于5-HT受体的5-HT含量，提高了5-HT受体表达。

综上，水针、白针和埋线均能缓解便秘症状，改善肠道组织结构，调节肠道运动和神经递质的含量。其中，水针与埋线效果更佳，推测水针发挥了针和药的协同作用；埋线可以长期刺激穴位，同时对大鼠的应激反应较小。