PEDV-RBD基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定

伊立超，李乐天，郝嘉翼，时小双，张 爽，高子函，金宁一，娄安钢*，李 昌* (.延边大学 农学院，吉林 延吉33000；.中国农业科学院 长春兽医研究所 中国医学科学院 人兽共患病毒病防控关键技术研究创新单元，吉林 长春 30)

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是尼多病毒目(Nidoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)的α-冠状病毒属成员，能够引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。1971年英国首次报道了PEDV，1978年该病在英国[1]和比利时[2]暴发期间进行了病原鉴定，我国于1984年确定猪群存在PEDV感染[3]，2013年美国首次从猪中分离到PEDV[4]。猪群感染PEDV后，其免疫力大幅度下降，导致继发感染其他病原体，使得病情更加复杂[5-6]。

1.2治疗方法:对照组患者给予吸氧、保持呼吸道通畅,抗感染,平喘,祛痰,适当强心,利尿,纠正水、盐、电解质及酸碱平衡紊乱等综合治疗。观察组在对照组基础上,另外给予低分子肝素钙4000U皮下注射,2次/d,再给予前列地尔10μg静脉注射,1次/d,总疗程10d。

PEDV表面具有一个18～23 nm纤突的囊膜结构，纤突呈花瓣状，由核心向四周呈放射状分布，纤突末端呈球状；病毒直径为95～190 nm，是一种单股正链、不分节段RNA病毒。PEDV基因组大小约为28 kb，含有7个开放阅读框，分别编码大小为150 ～ 220 kDa的病毒纤突糖蛋白(S)、20～30 kDa的次要嵌合蛋白(M)、7 kDa的主要嵌膜蛋白(E)、58 kDa的核衣壳蛋白(N)与其他蛋白。PEDV整个基因组的编码顺序为5′UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3′UTR[7-8]。病毒表面的纤突蛋白(spike，S)具有介导细胞附着和膜融合的作用[9]。某些哺乳动物冠状病毒的S蛋白能被相关的蛋白酶切割成S1和S2；S1具有受体结合位点，S2具有融合活性。S1区内318～510氨基酸残基可与ACE2[10-12]的肽酶域紧密结合。该片段为受体结合域(receptor-binding domain，RBD)，是决定病毒-受体相互作用的关键序列，也决定着病毒的宿主范围和嗜性[13]。

目前预防PED的疫苗常用甲醛氢氧化铝灭活苗，但疫苗株与近期流行株同源性较低，能保护仔猪免受PEDV流行株感染的高效廉价的疫苗需求更加迫切[14]。为此，本试验针对高发的GⅡ-a型流行株PEDV的S蛋白中的RBD，应用杆状病毒表达系统进行PEDV受体结合区(PEDV-RBD)基因表达，为PEDV诊断和亚单位疫苗研制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种及试剂T4DNA连接酶、DNA Marker、Trans1-T1感受态细胞购自TaKaRa公司；pFastBacTM双载体、EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、DH10 Bac感受态购自Thermo Scientific公司；Anti-strep tag抗体购自Abcam；PEDV S蛋白抗体购自云之羽生物；HRP标记山羊抗鼠IgG、FITC标记山羊抗鼠IgG购自碧云天生物技术公司。

1.2 目的基因设计与合成参考GenBank登录的PEDV S蛋白基因序列(AKN45969.1)，选取其RBD基因序列，在序列上游添加EcoR Ⅰ酶切位点，下游添加Xba Ⅰ酶切位点，设计完成后，进行杆状病毒表达系统偏爱密码子优化，由南京金斯瑞公司合成。

1.3 重组质粒的构建与鉴定将合成的基因PEDV-RBD亚克隆至杆状病毒双表达载体的PH启动子下游，命名为pFBD-PER，用EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ进行双酶切鉴定。

泰州大桥针对不同等级风险建立了层次分明的责任体系：重大风险需上报上级主管部门，同时风险控制措施的实施由公司安全办公室直接负责；较大风险由公司安全部门直接负责；一般风险由基层管理单位负责人负责；可忽略风险由生产现场作业人员根据需要合理控制.

1.4 重组杆粒的制备将质粒pFBD-PER转化到DH10BacTM感受态细胞中，制备含有10 mg/L 四环素、50 mg/L 硫酸卡钠霉素、7 mg/L 庆大霉素、40 mg/L IPTG和100 mg/L X-Gal 蓝白斑筛选平板。将热激后的感受态细胞涂布在平板上，在37℃温箱中倒置培养48 h。挑取较大的白色菌落到液体三抗(四环素(10 mg/L)、硫酸卡钠霉素(50 mg/L)、庆大霉素(7 mg/L)培养基中，在37℃、220 r/min摇床培养12 h。按照表1引物进行菌液PCR鉴定，将鉴定正确的菌株提取杆粒，命名为Bacmid-PER。

表1 引物信息

1.5 重组杆状病毒的拯救在6孔板中27℃培养Sf9细胞至80%，更换2 mL完全培养基(含1.5%胎牛血清Grace's培养基)，使用双无Grace's培养基稀释4 μg阳性重组杆粒Bacmid-PER与4 μL CellfectinTMⅡ Reagent混匀，静置20 min后，缓慢均匀加入6孔板中，27℃培养6 h，换液为Sf-900 Ⅱ完全培养基，27℃培养5～7 d，每天观察细胞状态，待大部分细胞出现病变时，收取上清为第1代重组杆状病毒，命名为rBV-PER，然后继续盲传3代。

1.6 间接免疫荧光法(IFA)鉴定PEDV-RBD蛋白的表达将Sf9细胞均匀铺入6孔板，待细胞长至70%，接种重组杆状病毒rBV-PER，每孔20 μL。27℃培养48 h后弃掉培养基,用4%多聚甲醛固定液固定30 min，Trion X-100透化处理10 min，PBS清洗1次。5%脱脂乳封闭1 h，1∶1 000稀释Anti-strep tag抗体，1∶1 000稀释抗PEDV S蛋白抗体，各室温孵育2 h;PBS清洗1次,用1∶2 000稀释FITC-标记的山羊抗鼠IgG，室温避光孵育1 h，PBS清洗1次后，用荧光显微镜进行观察。

1.7 Western blot检测PEDV-RBD蛋白的表达收集感染rBV-PER的Sf9细胞，细胞破碎处理后，12 000 r/min离心2 min,收取上清制备蛋白样品。通过SDS-PAGE电泳，将蛋白转印至NC膜上，以1∶1 000稀释的Anti-strep tag为抗体，1∶1 000稀释抗PEDV S蛋白抗体，1∶5 000稀释的山羊抗鼠IgG为二抗，分别进行Western blot鉴定。

楚合磊等[6]总结了国内外废橡胶与废塑料在制造阻尼材料方面的研究和应用的成果。分别介绍了废橡胶作为减震降噪的阻尼材料在工程和工业中的研究应用，废胶粉与废塑料共混改性型阻尼材料、树脂型废胶粉阻尼材料的研究应用。研究表明，废橡胶和废塑料制造阻尼材料用于生产实践,不仅可以起到减震降噪作用,而且能够节约资源,具有显著的环保效益，对于资源的可持续性发展具有重要意义。

2.8 PER蛋白表达的条件优化将30，48，72，96 h按照接毒量1，5，8，10 MOI收获的细胞培养液3 000 r/min 离心5 min，收集上清液，进行Western blot鉴定，同时使用β-actin作为内参(图8)进行修正，选择表达量较高的48，72 h的目的条带和内参条带，用Image J进行灰度分析，内参修正后，用GraphPad Prism 6.02作图分析，t检验显示每两组均满足P<0.001，差异极显著，表明10 MOI、48 h的表达量为最高(图9)。

2 结果

2.1 目的基因测序结果分析本研究所选取的目的基因序列来自于我国南方流行株(GenBank登录号：AKN45969.1)，为GⅡ-a型流行株，将其与NCBI上已知的我国比较典型的其他毒株的PEDV-RBD序列进行基因进化分析(图1)，同源性分析显示，该氨基酸序列与其他分离株的同源性为93.3%～100.0%，表明RBD基因氨基酸序列具有一定的保守性。

图1 PEDV-RBD基因分析

2.2 目的基因设计与合成以PEDV流行株(NCBI ID：AKN45969.1)S蛋白为基础，利用信号肽预测工具，保留氨基酸残基1～18位置作为信号肽，507～640位置为RBD(图2A)，同时，N端添加Kozak起始序列、Twin-Strep 标签，两端分别添加酶切位点EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ(图2B)。

图2 PEDV-RBD基因结构示意图

夕阳透过玻璃窗，使整个房子变成了暖调子，炉上飘着烟，两老正忙着把拉长的面一片一片地揪下来，扔进飘着肉香的锅里。才让抽着烟，给我们讲述他和张伟的故事。此时此刻我只有一个心愿，回去一定要帮他找到张伟。

Adachi等[14]指出，硅质岩的Al/(Al+Fe+Mn)比值由0.01(纯热水成因)至0.60(纯生物成因)，并且其比值随距热水系统中心距离的增加而变大[15]。研究区硅质岩的Al/(Al+Fe+Mn)比值为0.16～0.48，平均为0.36。在Fe-Mn-Al三角判别图解(图2a)中，K6001G01和K9001E01落在热水成因硅质岩区，K7001H01、K7001H02和M5001G01落入非热水成因硅质岩区。

M.DL5000 DNA Marker；1.重组质粒；2.重组质粒双酶切产物图3 pFastBacTMDual-PER酶切鉴定结果

2.5 重组杆状病毒rBV-PER的获得重组杆粒Bacmid-PER转染Sf9细胞7 d内产生P1代毒，转染120 h后Sf9细胞均出现细胞变圆、体积变大、破裂，细胞数目减少，细胞核明显增大(图5A)。P3代重组杆状病毒感染Sf9细胞48 h，出现典型CPE(图5B)，而正常细胞无变化(图5C)，表明重组杆状病毒rBV-PER拯救成功。

M.DL2000 DNA Marker；1.菌液PCR；2.空白对照图4 Bacmid-PER菌液PCR鉴定结果

2.4 重组杆粒Bacmid-PER的鉴定利用表1引物对Bacmid-PER菌液进行PCR扩增，结果显示，应用引物PH-F和M13-R得到约为1 000 bp的条带，与预期结果一致(图4)，表明重组杆粒Bacmid-PER构建成功。

A.重组杆粒Bacmid-PER转染120 h的Sf9细胞病变；B.P3代重组杆状病毒感染48 h的Sf9细胞病变；C.正常的Sf9细胞图5 重组杆状病毒的拯救(400×)

2.7 重组蛋白pFBD-PER的Western blot鉴定收集感染rBV-PER的Sf9细胞，用IP裂解液和超声裂解液破碎，12 000 r/min离心2 min,收取上清制备蛋白样品。通过SDS-PAGE电泳，将蛋白转印至NC膜上，以1∶1 000稀释Anti-strep tag抗体，1∶1 000稀释抗PEDV S蛋白抗体，1∶5 000稀释的山羊抗鼠IgG为二抗，分别进行Western blot鉴定，可见25 kDa的目的蛋白条带，与理论值相符，表明PEDV-RBD蛋白成功表达并具有反应原性(图7)。

A.正常Sf9细胞；B.用Anti-strep tag抗体鉴定重组杆粒Bacmid-PER转染120 h的Sf9细胞；C.用抗PEDV S蛋白抗体鉴定重组杆粒Bacmid-PER转染120 h的Sf9细胞图6 IFA鉴定PEDV-RBD蛋白的表达

2.6 IFA鉴定PEDV-RBD蛋白的表达利用Anti-strep tag抗体和抗PEDV S蛋白抗体对重组杆状病毒进行IFA鉴定，结果显示，正常Sf9细胞未出现特异性荧光(图6A)，而感染重组病毒rBV-PER的Sf9细胞出现特异性荧光(图6B)，表明外源PEDV-RBD基因在杆状病毒中成功表达。

M.蛋白Marker；1. Anti-strep tag抗体鉴定重组蛋白pFBD-PER；2. 抗PEDV S蛋白抗体鉴定重组蛋白pFBD-PER；3. 空白对照图7 重组蛋白pFBD-PER的Western blot鉴定

1.8 PER蛋白表达的条件优化确定蛋白为可溶性表达后，按照不同接毒量(MOI为1，5，8,10)和不同表达时间(30，48，72，96 h)进行表达条件的优化，以期获得PER蛋白表达的最佳条件。接毒后按照以上时间每次收集1 mL细胞培养液，然后将细胞培养液3 000 r/min离心5 min，收集上清液，与内参β-actin同时进行Western blot鉴定，对Western blot条带进行灰度分析，相应的目的条带数值减去内参条带数值，重复3次，然后用GraphPad Prism 6.02作图分析。

2.3 重组质粒鉴定质粒pFBD-PER用EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ进行双酶切鉴定，结果显示，可得到1条约为680 bp的目的基因条带，表明质粒构建成功(图3)。DNA测序鉴定结果进一步表明，目的序列与原序列完全一致。

M.蛋白Marker；1～4.接毒量1，5，8，10 MOI图8 重组蛋白pFBD-PER的表达条件优化

1～4.接毒量1，5，8，10 MOI；注：每两组均满足P<0.001图9 重组蛋白pFBD-PER的表达条件优化灰度值分析

3 讨论

S蛋白作为PEDV的重要抗原，携带主要的B淋巴细胞抗原表位。B细胞表位由抗原表面的亲水性氨基酸组成，容易接近B细胞受体和抗体分子并被识别，诱导机体产生与PEDV特异性结合的中和抗体。

作为经济社会发展处于全国较高水平、基本公共服务供给绝对量处于全国领先的长三角地区，其基本公共服务是不是也存在比较严重的发展不均衡问题？与全国相比情况如何？造成这种状况的主要原因是什么？如何在全面小康目标的推进中，在区域基本公共服务的供给上不断满足人民群众不断增长的更高质量的服务需求？对于经济社会发展的一体化水平较高、早已提出率先实现全面高水平小康社会的长三角地区来说，研究上述问题显然可以为我们的政策实践提供价值导向和重要依据。

研究发现，用PEDV S1蛋白免疫怀孕母猪，通过其初乳哺乳的仔猪可以获得针对PEDV的被动体液免疫[15]。MAKADIYA等[16]成功构建PEDV S1蛋白的真核表达载体，并将其转染人胚肾HEK-293T细胞，Western blot结果显示该蛋白能与PEDV高免血清发生特异性反应；纯化该重组蛋白后免疫怀孕母猪，在其血清中即可检测到高滴度的PEDV中和抗体，PEDV攻毒后免疫组哺乳仔猪未表现出明显临床症状，且死亡率明显降低。沈安宁[17]构建原核表达载体，成功表达PEDV S蛋白并成功制备出单克隆抗体。王加圆[18]构建了PEDV S1抗原位点原核表达载体和真核表达载体，均成功串联表达S1抗原位点蛋白，用两种系统表达的蛋白免疫小鼠后血清中均产生了不同程度的特异性抗体和中和抗体。吴松[19]利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了PEDV S1蛋白，免疫猪后均产生了特异性抗体和中和抗体。武旺盛等[20]用HEK-293T细胞成功表达了PEDV S1蛋白，用蛋白免疫巴马小型猪后，诱导其产生黏膜免疫。

本研究针对的PEDV-RBD是重要的免疫原性区域，含有多个抗原表位[12]，其诱导产生的抗体多为中和性抗体，是阻断病毒与细胞结合，刺激宿主免疫反应、中和抗体及保护免疫系统免受病毒感染的主要成分。RBD的受体结合基序与细胞受体相互作用，介导病毒与宿主细胞的黏附。针对S蛋白RBD的特异性中和单克隆抗体可以有效地阻断病毒入侵，其被认为是一个关键的治疗靶点[21]。但尚未见围绕PEDV受体结合区开展表达或疫苗研究的相关报道。

（3）STA通过信道1（AP1使用的信道）向AP1发送802.11解除关联信息，解除STA与AP1间的关联。

本研究选用杆状病毒作为表达系统，因其作为一种重要的真核表达系统，目前研究比较成熟且高效。杆状病毒表达系统的表达产物在生物学活性、结构与功能特性、抗原性和免疫原性与天然外源基因产物非常相似。杆状病毒有很高的种属特异性，不感染脊椎动物，其表达产物生物安全性较高[22]。目前已有应用该系统进行BTV、HPV疫苗研究[23-25]的报道。

本研究将PEDV-RBD基因正确插入杆状病毒表达载体，成功构建了重组质粒pFBD-PER，并获得穿梭质粒;利用脂质体转染方法将质粒转染Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，成功地利用昆虫表达系统表达了PEDV-RBD蛋白，所表达蛋白的相对分子质量约为25 kDa；IFA和Western blot检测结果均表明，杆状病毒表达系统能够正确表达PEDV-RBD蛋白，且PEDV-RBD蛋白具有良好的抗原性。本研究首次利用昆虫杆状病毒真核表达系统成功表达了PEDV-RBD蛋白，为进一步研究PEDV-RBD蛋白的生物学功能、研发诊断试剂、制备基因工程亚单位疫苗奠定了基础，也为利用昆虫杆状病毒表达系统进行其他冠状病毒结构蛋白的表达提供了依据。