牛结节性皮肤病病毒GPCR基因荧光定量PCR检测方法的建立

原耀贤，孙铭澮，黄伟楠，李康健，何 威，付 强，马春全，刘 全，马 骏* (.佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528225；2.广东省揭阳市惠来县溪西畜牧兽医站，广东 揭阳 5525；.广州市微生物研究所有限公司，广东 广州 50700)

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，LSD)是由痘病毒科(Poxviridae)脊髓动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)的双链DNA病毒——牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)引起的牛病毒性疾病[1]。患病动物的皮肤表面会形成坚硬的结节或溃疡；发病过程中体温上升、精神萎靡、体质量减轻、伴有流泪、流涕和流涎。患病奶牛产奶量减少，母牛可能会流产并伴有几个月的不发情期，公牛会暂时不育或永久不育[2]，该病严重时会导致动物死亡。因此，LSD被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的疫病[3]，被我国进境疫病名录列为一类动物疫病。

LSD于1929年在非洲赞比亚首次被发现。2013—2017年LSD由非洲传入中东，逐渐形成了全球蔓延的趋势[4]。2019年8月，该病传入我国，在我国新疆伊犁地区首次暴发[5]。目前，LSD已在我国几个省份有报道发病并执行扑杀政策[6]。因此，鉴于LSD的流行趋势，建立一种准确、快速的LSDV检测方法具有重要意义。

实时荧光定量PCR方法(real-time quantitative PCR，qPCR)具有操作简便、特异性强、敏感性高等特点，广泛应用于病原微生物的临床检测中。目前，我国针对LSDV的qPCR检测方法的相关报道较少。因此，本研究基于LSDV的G-protein-coupled chemokine receptor(GPCR)基因，设计了针对LSDV的qPCR检测方法，为早期感染动物的发现和疑似病例的诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 病毒和疫苗山羊痘病毒(goatpoxvirus，GTPV)疫苗株(CVCC AV41)购自吉林正业生物制品股份有限公司。小反刍兽疫(peste des petits ruminants virus，PPRV)活疫苗(Clone 9株)购自天康生物股份有限公司。

1.2 主要试剂TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL2000 DNA Marker、Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T质粒、感受态细胞(DH5α)、PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix DimerEraser均购自TaKaRa公司；TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒购自TIANGEN公司；胶回收试剂盒购自Axygen公司；氯仿、无水乙醇、异丙醇等试剂均为分析纯，购自广州鼎国生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成根据GenBank中公布的LSDV-GPCR基因序列进行分析比对，合成LSDV-GPCR基因，长度为1 149 bp。以此为模板，用Beacon Designer 8.1软件设计1对特异性引物，上游引物qGPCR-F：5′-AGTCGAATATAAAGTAATCAGTC-3′，下游引物qGPCR-R：5′-CCGCATA-TAATACAACTTATTATAG-3′，扩增片段长度为125 bp。基因和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 重组质粒标准品的构建以合成的LSDV-GPCR基因为模板进行扩增。反应体系25 μL：2×Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL(10 μmol/L)，模板1.0 μL，ddH2O 7.5 μL。扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖电泳后按照胶回收试剂盒说明书步骤，回收纯化PCR产物，将其克隆于pMD19-T载体中，构建重组质粒pMD19T-LSDV。重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将阳性重组质粒作为阳性标准品。利用分光光度计测定重组质粒的D260 nm/D280 nm比值和浓度，根据公式：质粒拷贝数(拷贝/μL)=(质粒浓度×10-9×稀释倍数×6.02×1023)/(660 Da/碱基×碱基数)，将标准质粒浓度换算为拷贝数。

1.5 荧光定量PCR标准曲线的建立将pMD19T-LSDV重组质粒进行梯度稀释，得到7.11×102～7.11×109拷贝/μL等8个稀释度的标准品，将其作为反应模板。每个稀释梯度设3个样品重复并建立阴性对照。qPCR反应体系为20 μL：TB Green(2×)10 μL，上、下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。反应条件：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 10 s；60℃ 30 s，共40个循环。以标准品浓度的对数为X轴，Cq值为Y轴，绘制标准曲线。

1.6 特异性试验采用试剂盒提取GTPV疫苗株的基因组DNA，采用TRIzol法提取PPRV疫苗株的基因组RNA并通过反转录试剂盒获取其cDNA。利用建立的qPCR方法进行检测，以pMD19T-LSDV重组质粒为阳性对照，同时设立阴性对照，以验证该检测方法的特异性。

1.7 敏感性试验将pMD19T-LSDV重组质粒进行梯度稀释，获得7.11×102～7.11×109拷贝/μL等8个稀释度的标准品，将其作为模板，进行qPCR的敏感性检测。同时对相同模板进行普通PCR扩增，比较2种检测方法的敏感性。

1.8 重复性试验选取7.11×103～7.11×109拷贝/μL共7个浓度进行批内重复试验；在3个不同时间，对上述7个稀释度的质粒标准品进行批间重复性试验，每个浓度进行3次重复。根据模板Cq值计算批内、批间的变异系数(CV)，验证qPCR方法的可靠性和重复性。

1.9 模拟临床样品的检测临床采集牛的皮肤结节，泪拭子和鼻拭子各10份，分别添加不同浓度的阳性质粒标准品，混合均匀。采用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取基因组DNA，利用本试验建立的qPCR检测方法检测该组模拟临床样品，观察扩增产物的溶解曲线，并进行测序以及BLAST比对分析。

2 结果

2.1 LSDV重组质粒标准品的制备以合成的GPCR基因作为模板，用普通PCR方法进行扩增，结果显示，扩增产物大小约为1 149 bp，与预期大小相符(图1)。将目的基因克隆至pMD19-T载体中，构建重组质粒标准品pMD19T-LSDV，对获得的质粒进行测序及BLAST比对分析，确认其为含有目的基因的重组质粒。经紫外分光光度计测定，重组质粒的质量浓度为91.35 mg/L，经过公式计算得到拷贝数为7.11×1010拷贝/μL。

2.2 荧光定量PCR构建标准曲线以不同浓度的pMD19T-LSDV重组质粒为模板，进行qPCR扩增。通过分析溶解曲线可得，各模板的qPCR扩增产物的溶解峰整齐单一(图2)，溶解温度为(77.50±0.50)℃；以Cq值为纵坐标，以不同标准品梯度稀释的拷贝数的对数为横坐标，获得标准曲线，标准曲线的CV大于0.999(R2>0.999)，标准曲线方程为y=-3.185 2x+37.764，R2=0.999 3，扩增效率为106.04%，梯度稀释的模板与Cq值呈良好的线性关系(图3)。

图2 qPCR的溶解曲线

图3 LSDV qPCR检测方法的标准曲线

2.3 荧光定量PCR的特异性分析利用建立的qPCR方法对LSDV和GTPV的基因组DNA，PPRV的cDNA进行扩增，结果显示，该方法仅对LSDV有特异性扩增，对GTPV和PPRV均无荧光信号(图4)，表明该方法具有良好的特异性。

1.LSDV；2.GTPV；3.PPRV；4.阴性对照图4 qPCR特异性试验结果

2.4 敏感性试验以梯度稀释的pMD19T-LSDV重组质粒(7.11×102～7.11×109拷贝/μL)为模板，进行普通PCR检测和qPCR检测，结果显示，普通PCR可扩增该质粒的最低拷贝浓度为7.11×104拷贝/μL(图5)，建立的qPCR方法对7.11×102～7.11×109拷贝/μL的pMD19T-LSDV重组质粒均存在有效扩增曲线(图6)。2种方法相比，相差100倍。表明建立的qPCR方法较普通PCR更为敏感。

1～8.分别为7.11×109 ～7.11×102拷贝/μL；9.阴性对照图6 qPCR检测pMD19T-LSDV的敏感性结果

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2～9.重组质粒pMD19T-LSDV(7.11×109 ～7.11×102 拷贝/μL)图5 普通PCR扩增结果

2.5 重复性试验选取拷贝数为7.11×103～7.11×109拷贝/μL的重组质粒为模板，分别进行批内和批间重复性试验。结果显示，批内、批间的CV均小于1.5%(表1)，表明建立的qPCR检测方法具有较好的重复性。

表1 LSDV qPCR方法的重复性试验(n=3)

2.6 模拟临床样品检测用本研究建立的qPCR检测方法对30份模拟临床样品进行检测，观察扩增产物的溶解曲线。结果显示，模拟临床样品的扩增产物的溶解曲线整齐、单一(图7)，后经克隆测序确认，产物均为LSDV目标序列。试验表明，建立的qPCR方法能有效地从不同临床样品中检测出LSDV序列，且该方法在临床诊断上有良好的特异性。

图7 模拟临床样品的溶解曲线

3 讨论

LSD的传播对全世界多个国家造成严重的经济损失。该病严重影响奶牛的产奶量和肉牛的料肉比等价值指标，破坏牛皮等产品质量，对养牛产业的经济效益构成了巨大威胁。在暴发该病的初期及时进行免疫及控制措施，能有效地减缓LSD的蔓延。而LSD的防控和诊断，是减少经济损失的关键，这依赖于对早期疑似病例的有效诊断。

针对LSD的鉴别方法主要依赖分子生物学检测方法。目前， LSDV的检测方法主要有抗原抗体ELISA检测、Western blot、普通PCR、实时qPCR方法等[7]。ELISA和Western blot具有敏感性高和特异性强的优点，但山羊痘病毒属各成员之间关系密切，同源性高，且能产生共同的中和抗体，因此，这2种方法难以应用于LSDV的早期鉴别诊断[8]。普通PCR方法应用广泛，但有速度慢、敏感性低的缺点；而qPCR技术因其快速、简便、特异、灵敏、可定量等优点，能为临床的病原检测提供更多帮助。

qPCR方法分为染料法和探针法两种[9]。探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，缺点是要合成探针，提高了检测单位的门槛，也使检测成本相对提高。染料法经济实惠，但其特异性劣于探针法。聂福平等[10]已经基于探针法建立了鉴别检测LSDV野生毒株的qPCR方法，能有效区分野毒株与疫苗株。而本研究基于染料法建立的qPCR检测方法成本低，操作简便，能特异地检出LSDV，并且能有效的检测临床样品，对疫病的快速临床诊断具有重要意义。

本研究建立的qPCR方法能够快速、准确的检测出LSDV，是一种特异性强、敏感性高、重复性好的检测方法，可以应用于LSD的监测与防控。