猪流行性腹泻病毒HB2018的分离鉴定及致病性

耿 超，陆泓宇，梁 婉，周丹娜，杨克礼，郭 锐，袁芳艳，刘 威，高 婷 ，刘泽文，赵红梅，田永祥* (1.长江大学 动物科学学院，湖北 荆州 43405；.湖北省农业科学研究院 畜牧兽医研究所 农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，湖北 武汉 430064；3.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070)

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起一种以呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征的急性、高度接触性传染病。各年龄段猪对该病毒均易感，7日龄以内的哺乳仔猪症状最为严重，感染致死率高达90%～100%，给养猪业造成了极大的经济损失[1-2]。

2010年，世界范围内暴发大规模PEDV疫情，其中，PEDV的S基因变异是毒株毒力改变的主要原因[3]。病原学研究显示，与疫苗毒株CV777相比，流行毒株发生了较大的变异，其S基因同源性为91%～94%[4]。随着PEDV、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)二联灭活疫苗，PEDV、TGEV和猪轮状病毒(PoRV)(G5型)三联活疫苗以及抗病毒制剂等防控产品的商品化，PEDV疫情得到了控制[5-6]，但是PEDV的变异依然十分活跃，需要密切关注其变异趋势，为疫病的防控做好储备。

本试验分离得到1株可以在Vero细胞上稳定传代的PEDV变异株，并扩增测定其S基因序列，通过遗传进化分析，可以得出近年来PEDV流行株的变异趋势。测定分离株的病毒滴度以及设计动物回归试验，研究目前流行的PEDV变异株的特性，将为PEDV疫情的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料、细胞及实验动物17份病死仔猪的小肠病料采自湖北省发生腹泻的猪场，PEDV检测有7份为阳性，TGEV和伪狂犬病病毒(PRV)检测均为阴性；Vero细胞由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医室保存。10只26日龄健康仔猪购自湖北省某猪场，RT-PCR检测实验猪的PEDV、TGEV和PRV为阴性，PEDV-IgG酶联检测试剂盒(上海酶联)检测仔猪的血清抗体为阴性。

1.2 主要试剂DL2000 DNA Marker、2×Phanta Max Master Mix购自Vazyme公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、0.25%胰酶购自Gbico公司；中性红购自国药集团化学试剂有限公司；琼脂糖购自碧云天生物技术有限公司；RNA提取试剂盒购自Axygen公司；反转录试剂盒购自Thermo公司；产物纯化试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司；PEDV抗体IgG(PEDV-IgG)酶联检测试剂盒购自上海酶联科技生物科技有限公司。

1.3 样品的处理和检测将采集的病料剪取合适大小置于2 mL离心管底部，加入1 mL pH 7.4的PBS缓冲液。用组织破碎仪27次/s破碎10 min后，12 000 r/min离心5 min，取上清，根据AXYGEN公司的DNA/RNA小量提取试剂盒说明书提取基因组，运用多重RT-PCR的方法进行鉴定[7]。将PEDV为阳性的上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后，加入1%双抗，-80℃备用。

1.4 病毒的分离与纯化将1 mL处理好的病毒液接种单层Vero细胞，于CO2培养箱37℃孵育2 h，弃上清，加入含7.5 mg /L的胰酶DMEM培养基6 mL，待细胞出现70%～80%病变，收取病毒液，反复冻融3次分装备用。参照文献[8]的噬斑试验和病毒滴度的测定方法，利用Vero细胞纯化F20代的病毒液，运用Reed-Muench法计算病毒液的TCID50。

1.5 S基因的克隆参考NCBI公布的CV777毒株的序列，将S基因分为S1和S2两段，用Primer 5.0设计引物(表1)。提取PEDV分离株的总RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系(总体积为50 μL)：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，PEDV cDNA 3 μL，ddH2O 18 μL。反应条件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 150 s，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存2 h。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。按照产物纯化试剂盒说明书，纯化目的条带，进行T载体克隆，得到重组阳性质粒，送擎科生物科技(武汉)有限公司测序。

表1 PEDV S基因的PCR扩增引物

1.6 S基因的遗传进化与分析参照GenBank登录的PEDV的代表性毒株以及我国近几年流行毒株的S基因序列(表2)，运用Mega Ⅹ绘制遗传进化树，将HB2018株的S基因与不同时间不同地域分离的PEDV毒株进行对比分析。同时，将S基因的氨基酸序列与商品化疫苗株(CV777、DR13、AJ1102和LW/L)进行比对。

表2 PEDV参考毒株信息

1.7 动物试验10只26日龄断奶仔猪用PEDV-IgG酶联检测试剂盒检测仔猪的血清抗体为阴性。实验猪随机分成接毒组(n=5)和阴性组(n=5)，每个试验组的猪被饲喂在P2动物房。接毒组口服接种4 mL/只病毒液(TCID50为106.7/mL)，对照组口服接种相同剂量的DMEM培养基。接种猪和阴性对照猪在接种后每天观测腹泻情况，并采集直肠拭子进行病毒RNA的检测。在接种PEDV 6 d后，实施安乐死进行病理检查。腹泻通过粪便稠度评分来评估。粪便稠度评分标准如下：0=固体；1=糊状；2=半液态；3=液态，评分为2分或2分以上为腹泻。

2 结果

2.1 样品的检测结果通过多重RT-PCR检测，17份腹泻样品中检出PEDV阳性样品7份，约占41.18%，TGEV和 PRV阳性样品未检出。结果表明，湖北地区的仔猪腹泻病原主要为PEDV。

2.2 病毒的分离鉴定将PEDV阳性病料接种至Vero细胞后，有1份阳性病料能够在Vero细胞上出现明显的细胞病变(图1)，主要表现为细胞轮廓消失、细胞融合拉网及细胞死亡脱落。经过RT-PCR检测，试验成功分离得到1株PEDV，命名为HB2018株。运用Reed-Muench法计算HB2018分离株的病毒滴度为106.7TCID50/mL。

A.对照组；B.接毒组图1 Vero细胞接毒结果

2.3 S基因的扩增使用分离株基因组反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到S1和S2的目的条带，长度分别为2 208，1 953 bp(图2)。送擎科生物科技(武汉)有限公司测序得到S1和S2的序列，拼接得到全长为4 161 bp的S基因。

M.DL5000 DNA Marker；1.S1基因；2.S2基因图2 S基因的分段PCR扩增结果

2.4 S基因的遗传进化与分析将分离株S基因与NCBI上公布的典型序列进行比对(图3)。基于S基因绘制遗传进化树表明，PEDV毒株主要分为两个大的分支，GⅠ分支主要包含早期和经典PEDV毒株，而我国近几年的PEDV流行株基本属于GⅡ分支。HB2018株与我国近几年流行的毒株处于同一分支，与经典毒株CV777株等处于不同分支，同源性只有93.76%。HB2018株与我国近几年的流行株一样，均发生了明显的变异。此外，HB2018株与YC2014株、CH/HNLH/2015株和AHCZ-2株同源性较近，同源性分别为99.25%，99.13%，99.23%。

图3 PEDV分离株S基因的遗传进化分析

HB2018株与现有商品化疫苗株的S基因核苷酸和氨基酸进行比对，同源性比对结果显示，HB2018分离株与CV777和DR13(GⅠ亚群)的核苷酸同源性为93.76%和93.52%，与AJ1102和LW/L(GⅡ亚群)的核苷酸同源性为97.40%和97.00%(表3)。HB2018株与CV777和DR13(GⅠ亚群)的氨基酸同源性为93.44%和92.93%，与AJ1102和LW/L(GⅡ亚群)的氨基酸同源性为98.12%和96.90%(表3)。HB2018株与商品化疫苗株相比有11个氨基酸发生突变(表4)，这11个位点的突变与GⅠ、GⅡ亚群皆不相同，且与同属于GⅡ亚群的疫苗株在1 199位有1个氨基酸的插入。

表3 HB2018分离株S基因核苷酸和氨基酸同源性分析 %

表4 HB2018分离株与疫苗株S基因关键氨基酸的突变位点

2.5 动物试验接种PEDV的断奶仔猪中，接种后1 d出现轻微腹泻，此后腹泻症状加剧，在接种3 d时，断奶仔猪腹泻症状严重(所有评分均≥2)，随后，仔猪症状逐渐好转。在整个试验过程中，没有出现阴性对照的断奶仔猪出现腹泻或其他临床症状。在接种1～6 d，断奶仔猪的粪便稠度评分先上升后下降(每个时间点P<0.01)(图4)。通过RT-PCR检测断奶仔猪的直肠拭子，接毒组的3头仔猪在接种2 d检测到病毒RNA，接种3～6 d，接毒组的断奶仔猪均检测到病毒RNA。整个试验过程中，没有阴性对照猪的粪便中可检测到病毒RNA(表5)。在安乐死的接种断奶仔猪中没有明显的大体损伤。断奶仔猪的组织学检查显示，小肠的肠壁变得薄而透明，并且在小肠腔中积聚了大量的液体(图5)。阴性对照组的小肠及大肠等其他器官未见明显组织学损伤。

腹泻通过粪便稠度评分来评估。粪便稠度评分如下：0=固体；1=糊状；2=半液态；3=液态，评分为2分或2分以上为腹泻。每个数值为5头断奶仔猪的平均值图4 断奶仔猪粪便稠度评分

表5 断奶仔猪直肠拭子病毒RNA检测

3 讨论

本研究分离获得1株命名为HB2018的PEDV毒株，扩增其S基因，并分析S基因核苷酸和氨基酸的同源性。根据GUO等[9]的分型依据，HB2018株属于GⅡa亚群，与CV777等经典毒株的同源较低，仅为93.76%，处于不同的分支，与2011年以后我国分离报道的PEDV变异株(GⅡ亚群)处于同一分支，但与AJ1102、LW/L等GⅡ亚群的疫苗株相比，分离株HB2018依然处在不同分支，PEDV依然存在继续变异的潜在风险。氨基酸同源性分析显示，PEDV与现有的商品化疫苗株有较大差异，PEDV正在出现新的变异。由此可见，近几年我国的PEDV依旧处于不断地变异中，需要与流行株相匹配的疫苗株，研究HB2018分离株的特性，将为PEDV疫情的控制提供技术储备。

通过动物试验可知，分离株HB2018口服感染断奶仔猪，仔猪均出现腹泻症状，随后好转，但直肠拭子中可以检测到PEDV 的RNA，组织学检测小肠出现病变，由此可知，PEDV引起哺乳仔猪死亡主要为小肠损伤，脱水致死，结果与JUNG等[1]的研究相一致。此外，有研究对不同日龄仔猪进行动物回归试验，也证实了PEDV可引起仔猪小肠的组织学病变[10-11]。LIU等[12]测定直肠拭子PEDV RNA滴度的结果，与本研究中仔猪排毒的时间一致。

全球范围内广泛流行的PEDV流行株与经典株及疫苗株的基因序列发生了很大程度的变异，其S基因核苷酸序列与报道的PEDV流行株与经典株出现了较大的差异。原因是冠状病毒基因组为单股正链的RNA病毒，稳定性较差，易发生突变。2010年以来，我国暴发的大规模PEDV感染疫情是PEDV发生了较大变异所导致。王婧怡等[13]调查发现，我国原种猪场的PEDV血清阳性值较高，PEDV的疫情依然严峻。此外，PEDV还在变异，这种变异可能对PEDV的防控提出新的挑战，需加强该病原的流行病学研究，密切关注病原的遗传变异。因此，研究当前PEDV主要流行株为防控PED的发生有重要的意义。